使用MALDI-TOF质谱法鉴定酶降解产生的RNA片段

质谱法已被广泛用于各种应用。本文中的方法提供了从体外酶促过程获得的RNA片段的明确表征。该技术的优点包括获得分子铁峰，可以使用少量材料进行实验以进行体外应用，并且可以通过最少的训练来完成方案。

所描述的方法可以广泛应用于研究涉及DNA，RNA或蛋白质的过程。示例包括生化转化，例如交叉信息，化学修饰的鉴定或其他生物聚合物相互作用和反应性。一个困难可能发生在获得MALDI光谱仪或提供此服务的核心设施上。

另一个方面是确定检测限，根据仪器的不同，检测限可能更高或更低。首先，打开紫外可见分光光度计，然后单击珀金埃尔默UV WinLab图标以打开仪器操作控制窗口。使用仪器右侧的开关打开帕尔贴温度控制器分光光度计，然后单击"基本方法"下的 Scan-Lambda 365。

将打开另一个屏幕，提示用户确保电池座为空。单击"确定"并允许仪器进行系统检查。现在，通过选择"数据收集"来调整扫描参数。

在新窗口中的"扫描设置"下，将起点更改为 350 纳米，将终点更改为 215 纳米。通过选择配件左侧的加号来激活珀尔帖。然后单击"多细胞帕尔贴"，将温度摄氏度更改为25摄氏度，然后单击"帕尔贴开"，导航到样品信息选项卡，输入所需的样品数量、名称和细胞位置。

单击"自动归零"并插入包含背景解决方案的比色皿。单击"开始"（Start） 并将比色皿插入所需的单元格中，并确保比色皿窗口的方向平行于仪器的正面。现在，单击"确定"以25摄氏度开始第一次扫描。

要在较高温度下进行测量，请单击多孔帕尔贴，将温度更改为所需的样品温度并重复扫描。单击"文件"，"导出"并选择所需的文件位置，然后选择"XY 数据"以获取文本文件。为了进行RNA的5'磷酸化，通过加入33.5微升无RNA酶的水，5微升溶液A，6微量10毫摩尔三磷酸腺苷，1微量200微摩尔RNA水溶液和4.5微升多核苷酸激酶在0.6微升微量离心管中制备溶液，并轻轻混合溶液。

将反应混合物置于水浴中，在37摄氏度下孵育45分钟。然后通过将反应管置于加热块中来灭活酶，在65摄氏度下预热10分钟。让溶液冷却至室温，以产生最终的5'磷酸化RNA溶液。

孵育后，使用50微升该溶液，加入5微升溶液B和5微升Xrn-1的1-飞托莫溶液进行RNA水解。将反应管在室温下孵育两小时。将该反应混合物转移到10千道尔顿孔径离心装置中，并通过以700倍G离心10分钟过滤酶。

然后，加入20微升无RNase的水以洗涤离心管上的残留RNA，然后离心。最后，将该滤液与先前通过在10千道尔顿孔径离心装置中离心得到的所得滤液结合，并将溶液在零摄氏度或船舶上冷冻以进行分析。要对样品进行脱盐和浓缩，请使用市售的阳离子交换C18移液器吸头，其末端装有C18色谱介质床。

为此，将10微升移液器吸头放在10微升移液器上，并用50%乙酰丁腈水溶液清洗该吸头两次。每次将用过的体积丢弃到单独的废物管中，并用10微升0.1%三氟乙酸水溶液平衡C18尖端两次。从移液器中手动取出C18吸头，并将其固定在装有P200移液器吸头的200微升移液器上。

然后将C18尖端浸入Xrn-1水解RNA寡核苷酸期间制备的所得溶液中，并吸出溶液通过C18尖端释放10次。现在，从P200移液器中取出C18吸头，将其定位到10微升移液器中，并使用0.1%三氟乙酸溶液的水溶液洗涤C18吸头两次。每次将用过的体积丢弃到单独的废液管中。

用10微升无RNase的水清洗C18尖端两次。为了在MALDI板上发现，通过将样品浸入所需的基质中并将溶液分配回管中10次，从C18尖端洗脱RNA寡核苷酸。将此溶液移出到板上两个单独的点上，每个点一微升，并允许光斑风干。

这项工作中使用的RNA浓度是通过在90摄氏度下记录的紫外可见光谱测定的，以避免由于二级结构的潜在形成而产生的错误读数。事件的总体顺序包括两个部分。一，RNA的高效5'磷酸化，仅出现一个对应于预期产物的峰来证明。

二、失速片段由用Xrn-1处理样品混合物而产生的。使用包含两个氧化病变的不同序列获得相同的结果。需要考虑的潜在变化包括消除滤波装置的使用或考虑使用不同的矩阵进行MALDI点测。

例如，西那酸或吡啶甲酸。RNA片段是从酶促过程中获得的。该工艺是通过耦合MALDI，电泳分析，固相合成和圆二向色性建立的。

所描述的协议有可能用于各个领域，从化学科学研究到生物医学领域的应用。