使用硫酸二甲酯探测RNA结构 体 外 和细胞测序突变分析

DMS-MaP是一种基于测序的方法，它使我们能够获得RNA结构的快照，并了解它在不同条件下的变化。与传统的结构测定方法（如晶体学和电子显微镜）相比，DMS-MaP可用于细胞和去卷积RNA结构集合。由于RNA结构在多种生物现象中都有影响，我们的方法可以为几乎任何生物学研究领域提供机理见解。

首先将89微升的复性缓冲液转移到指定的1.5毫升管中，用于每个反应，最终体积为100微升。在放置在化学罩下方的恒温摇床中将试管在 37 摄氏度下预热。将 10 微升无核酸酶的水加入 PCR 管中，并在其中转移 1 到 10 皮摩尔的 RNA。

将其在95摄氏度的热循环仪中孵育一分钟以使RNA变性。然后立即将试管放在冰块上，以避免RNA错误折叠。现在，要重新分配RNA，请将样品添加到含有37摄氏度重折叠缓冲液的指定管中，并在孵育10至20分钟之前充分混合。

接下来，将一微升浓度为10.5摩尔的100%硫酸二甲酯或DMS加入含有RNA样品的管中，并将反应混合物孵育五分钟，同时以每分钟800至1， 400转的速度振荡。反应五分钟后，用60微升100%β-巯基乙醇淬灭，并在涡旋前充分混合，并立即将RNA置于冰上。然后净化RNA并将其洗脱在10微升无核酸酶水中。

使用分光光度计定量RNA。最后，将修饰的RNA储存在零下80摄氏度。将反应混合物加入PCR管后，将至少100纳克洗脱的修饰RNA转移到10微升无核酸酶水中到PCR管中。

将混合物在57摄氏度下在热循环仪中孵育30分钟至1.5小时。30分钟足以制成含有500个核苷酸的产品。接下来，加入一微升四摩尔氢氧化钠，用移液器充分混合，在95摄氏度下孵育三分钟以降解RNA，并从互补DNA中释放TGIRT。

使用基于柱的方法去除引物，净化互补DNA。并进行PCR以扩增它。在进行文库制备之前，通过在琼脂糖凝胶上运行两微升PCR产物来验证PCR成功。

然后使用分光光度计定量提取的片段，然后索引片段进行测序。将生长到所需感染阶段的病毒感染细胞转移到具有所需生物安全水平的专用且适当的通风橱中。向含有细胞的培养基中加入2.5%体积的DMS，并用封口膜密封容器。

立即将容器在 37 摄氏度下孵育五分钟。孵育后，小心地移出含DMS的培养基并将其丢弃到适当的化学废物中。然后轻轻地将10毫升停止缓冲液加入细胞中，刮擦细胞，并将它们转移到15毫升锥形管中。

通过将试管以3， 000g离心三分钟来沉淀细胞。除去上清液，用10毫升PBS洗涤细胞沉淀两次。洗涤后尽可能小心地去除残留的PBS。

将沉淀溶解在适量的RNA分离试剂中以进行RNA提取。接下来，将200微升氯仿加入RNA分离试剂中的1毫升匀浆细胞中，并涡旋15至20秒，直到细胞溶液变成亮粉红色。等到发生相分离，这由底部的粉红色脂质相沉降表示。

在 4 摄氏度下以大约 20， 000 g 的速度旋转试管 15 分钟，然后将上层水相转移到新试管中。净化RNA并在足够体积的无核酸酶水中洗脱。然后，在使用优选方法进行核糖体RNA去除后，在足够体积的无核酸酶水中洗脱RNA，并使用分光光度计对其进行定量。

纯化的RNA可以再次用于RT-PCR。使用上述Web服务器，可以方便地分析DMS-MaP数据。读取映射到参考，并计算每个碱基突变。

得到的群体平均文件可以用作众所周知的RNA结构预测软件的约束。由此产生的最小自由能结构可以使用VERNA等软件进行可视化。截至目前，只有稳定版本的DREAM可以去卷积RNA结构集合。

但是，使整个社区更容易访问此功能的工作正在进行中。通过附着T7聚合酶启动子延长的gBlock片段的体外转录产生了感兴趣的RNA，在1%琼脂糖凝胶上以300个核苷酸的单条带形式出现。在DMS修饰的RNA上进行的基因特异性RT-PCR的成功是通过2%琼脂糖凝胶上300个碱基对的单条带来指示的。

索引片段如预期的那样高出大约 150 个碱基对。对HCT-8细胞进行DMS治疗，在病毒感染后4天显示出细胞病变效应。提取的总RNA在琼脂糖凝胶上显示为两条亮条带，占40S和60S亚基。

核糖体RNA耗竭后，两条亮条带消失，在相应的泳道上留下涂片。文库制备后，样品具有不同的大小分布，并显示为涂片。切除200至500个核苷酸的条带，并分离出适配器二聚体。

SARS-CoV-2基因组的结构模型显示，与参与碱基配对的碱基相比，具有开放构象的碱基具有更高的反应性。碱基的反应性曲线表明尿嘧啶和鸟嘌呤具有低反应性值，并且未被DMS修饰。通过我们的方法，我们能够以高通量的方式预测细胞中的结构，而不受尺寸限制。

控制指标非常重要，因为它们提供了对结构预测准确性的洞察。为了进一步验证预测的准确性，应该进行更多干扰或改变结构的实验。