La spectrométrie de masse a été largement adoptée pour diverses applications. La méthodologie de cet article fournit la caractérisation sans équivoque de fragments d’ARN obtenus à partir d’un processus enzymatique in vitro. Les avantages de cette technique comprennent que le pic de fer moléculaire est obtenu, que les expériences peuvent être réalisées avec de petites quantités de matériel pour des applications in vitro et que le protocole peut être accompli avec un minimum de formation.
La méthodologie décrite peut être largement appliquée aux processus d’étude impliquant l’ADN, l’ARN ou les protéines. Les exemples incluent les transformations biochimiques telles que les informations croisées, l’identification des modifications chimiques ou d’autres interactions et réactivités des biopolymères. Une difficulté peut survenir en raison de l’accessibilité à un spectromètre MALDI ou à des installations de base qui offrent ce service.
Un autre aspect est l’établissement de la limite de détection qui peut être plus ou moins élevée selon l’instrument. Pour commencer, allumez le spectrophotomètre UV-Vis, puis cliquez sur l’icône PerkinElmer UV WinLab pour ouvrir la fenêtre de contrôle du fonctionnement de l’instrument. Allumez le spectrophotomètre du régulateur de température Peltier à l’aide de l’interrupteur situé à droite de l’instrument et cliquez sur Scan-Lambda 365, présent sous Méthodes de base.
Un autre écran s’ouvrira et invitera l’utilisateur à s’assurer que les supports de cellule sont vides. Cliquez sur OK et laissez l’instrument effectuer ses vérifications du système. Maintenant, ajustez les paramètres d’analyse en sélectionnant Collecte de données.
Dans la nouvelle fenêtre sous Paramètres de numérisation, modifiez le début à 350 nanomètres et la fin à 215 nanomètres. Activez le Peltier en sélectionnant le plus à gauche de l’accessoire. Cliquez ensuite sur Multiple Cell Peltier, modifiez les degrés de température Celsius à 25, puis cliquez sur Peltier On.Accédez à l’onglet d’informations sur l’échantillon et entrez le nombre d’échantillons, les noms et la position de cellule souhaités.
Cliquez sur Autozero et insérez la cuvette contenant la solution d’arrière-plan. Cliquez sur Démarrer et insérez la cuvette dans la cellule souhaitée et assurez-vous que la fenêtre de la cuvette est orientée parallèlement à la face avant de l’instrument. Maintenant, cliquez sur OK pour commencer la première analyse à 25 degrés Celsius.
Pour des mesures à des températures plus élevées, cliquez sur Multiple Cell Peltier, modifiez la température à la température d’échantillon souhaitée et répétez le balayage. Cliquez sur Fichier, Exporter et choisissez l’emplacement de fichier souhaité et sélectionnez XY Data pour obtenir un fichier texte. Pour effectuer une phosphorylation de 5' de l’ARN, préparer une solution dans un tube de microcentrifugation de 0,6 microlitre en ajoutant 33,5 microlitres d’eau sans RNase, cinq microlitres de solution A, six microlites d’adénosine triphosphate de 10 millimolaires, une microlite de solution aqueuse d’ARN micromolaire de 200 et 4,5 microlitres de polynucléotide kinase et mélanger doucement la solution.
Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes en le plaçant dans un bain-marie. Ensuite, inactiver l’enzyme en plaçant le tube de réaction dans un bloc thermique, préchauffé à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Laisser la solution refroidir à température ambiante pour obtenir une solution finale d’ARN phosphorylé de 5'.
Après l’incubation, utilisez 50 microlitres de cette solution, ajoutez cinq microlitres de solution B et cinq microlitres de solution de 1 femtomole de Xrn-1 pour effectuer l’hydrolyse de l’ARN. Incuber le tube de réaction à température ambiante pendant deux heures. Transférer ce mélange réactionnel dans un dispositif centrifuge de la taille d’un pore de 10 kilodaltons et filtrer les enzymes en les centrifugant pendant 10 minutes à 700 fois G.Transférer le filtrat dans un tube centrifuge de 0,6 millilitre.
Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’eau sans RNase pour laver l’ARN résiduel sur le tube centrifuge, suivi d’une centrifugation. Enfin, combinez ce filtrat avec le filtrat résultant obtenu précédemment par centrifugation dans un dispositif centrifuge de la taille d’un pore de 10 kilodaltonnes, et congelez la solution à zéro degré Celsius ou expédiez pour analyse. Pour dessaler et concentrer l’échantillon, utilisez des embouts de pipette C18 échangeurs de cations disponibles dans le commerce chargés d’un lit de milieu de chromatographie en C18 à son extrémité.
Pour cela, positionnez la pointe de la pipette à 10 microlitres sur une pipette à 10 microlitres et lavez cette pointe deux fois avec une solution aqueuse d’acétyl nitrile à 50%. Jeter les volumes utilisés dans un tube de déchets séparé à chaque fois et équilibrer la pointe C18 avec 10 microlitres de solution aqueuse d’acide trifluoroacétique à 0,1% deux fois. Retirez manuellement la pointe C18 de la pipette et fixez-la sur une pipette de 200 microlitres contenant une pointe de pipette P200.
Ensuite, immergez la pointe C18 dans la solution résultante préparée lors de l’hydrolyse des oligonucléotides de l’ARN par Xrn-1 et aspirez la libération de la solution à travers la pointe C18 10 fois. Maintenant, détachez la pointe C18 de la pipette P200, positionnez-la sur une pipette de 10 microlitres et lavez la pointe C18 à l’aide d’une solution aqueuse d’acide trifluoroacétique à 0,1% deux fois. Jetez les volumes usagés dans un tube à déchets séparé à chaque fois.
Lavez la pointe C18 avec 10 microlitres d’eau sans RNase deux fois. Pour repérer sur la plaque MALDI, éluez l’oligonucléotide d’ARN de la pointe C18 en immergeant l’échantillon dans la matrice souhaitée et en redistribuant la solution dans le tube 10 fois. Pipeter cette solution sur deux points séparés d’un microlitre chacun sur la plaque et laisser sécher les taches à l’air.
La concentration d’ARN utilisée dans ce travail a été déterminée par spectroscopie UV-Visible enregistrée à 90 degrés Celsius pour éviter les lectures erronées résultant de la formation potentielle des structures secondaires. La séquence globale des événements comprenait deux parties. Premièrement, la phosphorylation efficace de l’ARN à 5', mise en évidence par l’apparition d’un seul pic correspondant au produit attendu.
Et deuxièmement, le fragment de décrochage résultant du traitement du mélange d’échantillons avec Xrn-1. Les mêmes résultats ont été obtenus en utilisant une séquence différente qui contenait deux lésions oxydatives. Les changements potentiels à envisager comprennent l’élimination de l’utilisation du dispositif de filtrage ou la prise en compte de différentes matrices pour le repérage MALDI.
Par exemple, l’acide sinapinique ou l’acide picolinique. Les fragments d’ARN ont été obtenus à partir d’un processus enzymatique. Ce processus a été établi en couplant MALDI, l’analyse électrophorétique, la synthèse en phase solide et le dichroïsme circulaire.
Le protocole décrit a le potentiel d’être utilisé dans divers domaines, de la recherche en sciences chimiques aux applications dans le domaine biomédical.
