通过直接生物测定法鉴定海葵粗提取物中的溶血和磷脂酶活性

海葵毒素相互作用必须使用最少数量的生物体和有效的协议来获得毒素的巨大多样性和丰度，并快速鉴定特定毒素。我们结合了两种有效的技术来制备含有大量蛋白质的粗提取物，并描述了可重复的，特异性的，快速的和廉价的测定方法，以鉴定海葵毒液中的溶血和磷酸碱基。该方法可用于几乎任何决定鉴定一种或两种类型的细胞溶解素的示例。

该方法的效率是通过在制备粗提取物时注意每个步骤的时间来实现的。溶血的关键是小心处理红细胞以避免机械裂解，并且在磷解测定中，注意制备板的温度。来自我实验室的Santos Ramirez-Carreto博士，生物学家Sandra Salazar Garcia和生物学家Giovanni Macias Martinez将演示该程序。

首先用蒸馏水清洁收集的海葵A.doi，以去除粘附在身体上的大基质颗粒。立即将微生物在零下80摄氏度的超低温冰箱中冷冻72小时。然后，将生物体置于特殊的玻璃杯中，在冻干条件下冷冻干燥48小时。

对于组织水合作用，用60毫升50毫摩尔磷酸钠缓冲液和一片抑制剂鸡尾酒片重重建20克干重的冻干生物。在磁力搅拌器中，以约800 RPM和4摄氏度连续搅拌样品12小时。将样品在零下20摄氏度冷冻12小时以诱导细胞裂解和线虫囊排出后，将容器置于室温下的水中直至解冻至90%重复此过程三次。

为了澄清提取物，将样品在4摄氏度下以25，400倍G离心40分钟。回收上清液并再次离心。重复步骤三到四次，最后回收上清液。

回收的上清液或粗提取物含有毒液成分和其他细胞分子，如脂质，碳水化合物和核酸。使用商业布拉德福德比色测定试剂盒测定粗提取物的蛋白质浓度。将样品在室温下孵育五分钟而不摇动。

然后，测量595纳米处的吸光度。绘制样品BSA吸光度的平均值并确定图形的方程，其中y是吸光度，m是线的斜率，x是蛋白质浓度，b是原点的纵坐标。为了分析粗提取物，将30微克粗提取物加入5微升蛋白质上样缓冲液中以使蛋白质变性。

最终体积必须小于 50 微升。以25毫安恒定值运行电泳1小时30分钟。为了避免凝胶蛋白的扩散，将固定溶液加入蛋白质中，并在室温下以80RPM振荡孵育40分钟。

然后，倾析溶液并加入蛋白质交联溶液。在室温下孵育30分钟，以80RPM振荡。取出溶液，用100毫升蒸馏水洗涤凝胶五分钟。

之后，取出水并重复此过程四次。用50毫升考马斯亮蓝R-250过滤溶液进行蛋白质染色，在室温下以60 RPM在实验室旋转振荡器中搅拌15分钟。从绵羊的颈静脉中提取一毫升血液，并从注射器中取出针头。

立即将血液沥入装有50毫升Alsever溶液的管中，并在4摄氏度下以804倍G离心5分钟。弃去上清液，并通过沿管的内壁滑动上清液加入30毫升Alsever溶液。使用巴斯德塑料移液管缓慢重悬沉淀，并在4摄氏度下以804倍G再次离心溶液5分钟。

重复此过程，直到上清液澄清。保持Alsever溶液的最终体积，以达到大约每毫升200万个细胞的浓度。然后，使用Neubauer室或血细胞计数器对细胞进行计数。

将溶液混合物在37摄氏度下孵育一小时而不摇动，然后在4摄氏度下以804倍G离心板5分钟。在另一个具有平底的96孔板中回收上清液。如果粗提取物含有细胞溶解素，红细胞将裂解并释放血红蛋白。

读取415纳米处的吸光度，并计算在50%的红细胞中产生溶血的提取物量。增加海葵原油提取量，并使用适当的软件进行乙状调整设计地块。在蒸馏水中用1%SDS清洗一个鸡蛋，并在无菌条件下将蛋黄与蛋清分开。

准备溶液A，B，C和D.向溶液B和100微升溶液D中加入500微升溶液A和C.将它们混合并倒入每个培养皿中25毫升。等待溶液在无菌条件下固化，并用细管制作直径约2至3毫米的孔。在一个孔中加入总共20微升的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，在另一个孔中加入20微升确定的磷脂酶作为阳性对照。

将不同量的粗提取蛋白5，15，25，35和45微克放入剩余的孔中，每个孔的最终体积为20微升。在37摄氏度下孵育20小时。用于获得海葵粗提取物的方案的代表性结果表明，结合两种技术，搅拌和冷冻和解冻循环，产生了线虫囊肿的有效排出。

这里显示了刺激前后的线粒细胞。该图像中线囊小管暴露在外，表明毒素释放。海葵粗提取物的电泳曲线如图所示。

采用SDS-PAGE 15%聚丙烯酰胺凝胶对海葵粗提取物进行分析，显示蛋白质分子量从10千道尔顿到250千道尔顿。在这里，泳道1是蛋白质梯，泳道2是海葵毒液。在15千道尔顿和20千道尔顿的分子量区检测到细胞溶解素。

这里显示的是绵羊红细胞的溶血试验。在冷冻和解冻周期之前和期间，提取物的溶血活性增加，直到在最后两个周期中用50微克总粗提取物蛋白达到100%溶血。裂解50%羊红细胞所需的量为每毫升11.1 0.3微克。

通过在应用粗提取物样品的琼脂板区域形成透明光晕来检测磷脂酶活性。结果显示15微克总蛋白存在磷脂酶活性。光环的直径以剂量依赖性的方式增加;也就是说，如果粗提取物的量增加，光环的直径增加。

在尝试该过程时，确保诱导线虫囊团排出，定量总蛋白，通过SDS-PAGE电泳分析粗提取物，计算粗提取蛋白的量以产生50%的溶血，并在磷脂酶测定中使用不同量的蛋白质。我们可以通过蛋白质组学技术分析粗提取物，以鉴定在生物技术和生物医学中具有重要意义的多肽，甚至可以分析和表征独特的分子，然后在实验室中生产它以进行应用。我们获得了在人类顽固性肺癌上皮细胞中具有抗肿瘤活性的执行蛋白的部分序列。

同样，我们确定了生物技术感兴趣的磷脂酶序列。