基于贻贝 （Mytilus galloprovincialis） 血细胞运动的毒理学和生态毒理学测定

我们的研究范围是在评估作为模式生物的 Mytilus galloprovincialis 的血细胞运动的基础上，开发一种新的体外方法，用于快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。基于效果的方法，如体外和体内生物测定，是检测环境化学污染物对生物体影响的创新工具。这些方法可以用作环境生物监测和风险评估的工具。

这项研究通过专注于使用血细胞运动作为新终点来评估污染物对贻贝的影响，解决了毒理学方面的重大差距。尽管血细胞运动对免疫反应至关重要，但其对污染物暴露的敏感性在双壳类中研究不足。我们的发现以多种方式推进了毒理学和生态毒理学的研究。

通过为毒性筛选提供新的终点，通过最大限度地减少脊椎动物检测来支持伦理研究，并提高生态毒理学的适用性。这种方法可以在环境生物监测中具有广泛的应用，并且可以适用于生态毒理学中的其他免疫细胞。首先，在注射器中预填充 0.5 毫升标准生理盐水，调温至 15 摄氏度。

放置适应的成年贻贝标本以进行血淋巴采集。使用手术刀，沿腹面轻轻小心地撬开瓣膜。将手术刀保持在原位或使用移液器吸头保持空间开放。

然后，将皮下注射器的针头插入瓣膜之间的空间。使用预装注射器从后内收肌轻轻收集 0.5 毫升血淋巴液。现在，从注射器中取出针头，并将注射器的内容物转移到微管中。

将从 3 到 4 个贻贝收集的样品混合在一个保持 15 摄氏度温度的试管中。评估血细胞活力后，为了培养它们，将 50 微升稀释的血淋巴液加入 96 孔、平底、聚苯乙烯、TC 处理的微孔板的孔中，并用盖子盖住板。让血细胞在 30 摄氏度下粘附在孔底部 15 分钟，形成单层。

然后，使用微量移液器，轻轻地从孔中吸出多余的血淋巴液。要在 1 到 4 小时内进行短期检测，请立即加入 100 微升溶解在生理盐水中的目标物质。如需长时间暴露 24 至 48 小时，请将培养的贴壁细胞与溶解在补充培养基中的测试物质在 15 摄氏度下孵育。

首先，获得用目标物质处理的培养血细胞。为了增强血细胞的可视化，从每个孔中取出孵育培养基，并在延时显微镜检查前用 100 微升中性红色 vital 染料染色溶液对细胞进行染色。将细胞在 15 摄氏度的气候室中孵育 15 分钟。

孵育后，洗掉多余的染料，并加入 100 微升溶解在标准生理盐水中的目标物质。将含有处理细胞的多孔板插入多功能读数仪中。通过 20 倍放大倍率和明场可视化的延时显微镜对板进行实时成像。

对于细胞跟踪和计算速度参数，请使用 Gen5 软件获取单个帧，并将图像保存在名称中没有空格的文件夹中。在 ImageJ 中，导航到 文件，然后是 导入 和 图像序列.使用手动跟踪插件对单个细胞执行细胞跟踪。

将数据集从 ImageJ 手动跟踪插件导入趋化性和迁移工具软件。选择要跟踪的所需切片数。使用 X/Y 像素大小和时间间隔设置校准软件。

设置参数后，单击 Apply settings（应用设置）。绘制轨迹并导出为图像。单击 Measured values 按钮查看结果并保存数据。

然后，单击 Statistics 按钮并保存轨道序列的速度和方向性数据。将对照细胞的计算速度参数与暴露于不同浓度测试物质的血细胞的速度参数进行比较。使用延时成像评估血细胞运动，显示 10 分钟内单个细胞的运动，并在 0 、 5 和 10 分钟三个时间点一致跟踪编号细胞。

观察到血细胞的两种形态型，扩散细胞和较小的圆形星形细胞。由于板状伪足和伪足活动，两种类型都表现出连续的形状变化。速度和直接性图表明，在基础生理条件下，与较小的细胞相比，扩散的细胞移动得更快。

24 小时后，扑热息痛暴露显著降低了扩散细胞的运动性，而小细胞则没有这种减少。小细胞的直接性在扑热息痛暴露 24 小时后显著增加，而扩散细胞在仅 1 小时后就显示出降低的直接性。