אינטראקציה בין רעלני שושנת ים חייבת להשתמש במספר הנמוך ביותר של אורגניזמים ובפרוטוקולים יעילים כדי להשיג מגוון ושפע רב של הרעלים וזיהוי מהיר של רעלן מסוים. שילבנו שתי טכניקות יעילות להכנת התמצית הגולמית עם כמות גבוהה של חלבון ולתאר מבחנים הניתנים לשחזור, ספציפיים, מהירים וזולים לזיהוי בסיסים המוליזה ופוספוליים בארס שושנת הים. השיטה יכולה לשמש כמעט בכל דוגמה כי הוא החליט לזהות אחד או שני סוגים של cytolysins.
יעילות השיטה מושגת על ידי טיפול בזמנים בכל שלב תוך הכנת התמצית הגולמית. המפתח להמוליזה הוא טיפול זהיר של אריתרוציט כדי למנוע תזה מכנית, ובבדיקת פוספוליזה, טיפול בטמפרטורה בהכנת הצלחת. מי שידגימו את ההליך יהיו ד"ר סנטוס רמירז-קארטו, הביולוגית סנדרה סלאזאר גרסיה והביולוג ג'ובאני מסיאס מרטינז מהמעבדה שלי.
התחל על ידי ניקוי שושנת הים שנאספה A.doi עם מים מזוקקים ביד כדי להסיר את חלקיקי המצע הגדולים הדבקים בגוף. מיד להקפיא את האורגניזמים במינוס 80 מעלות צלזיוס ב ultrafreezer במשך 72 שעות. לאחר מכן, הניחו את האורגניזמים במשקפיים מיוחדים לייבוש בהקפאה עם תנאי ליופיליזציה למשך 48 שעות.
עבור הידרציה של רקמות, שחזרו את המשקל היבש של 20 גרם של אורגניזמים ליופיליים עם 60 מיליליטרים של מאגר נתרן פוספט 50 מילימולרי וטבליית קוקטייל מעכבת אחת. במערבל מגנטי, מערבבים את הדגימה באופן רציף בסביבות 800 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. לאחר הקפאת הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות כדי לגרום לתזה של תאים ופריקה נמטוציסטית, הניחו את המיכל במים בטמפרטורת החדר עד שהוא מפשיר עד 90% חזרו על הליך זה שלוש פעמים.
כדי להבהיר את התמצית, צנטריפוגה הדגימה ב 25, 400 פעמים G במשך 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשחזר את supernatant ו צנטריפוגה אותו שוב. חזור על השלב שלוש עד ארבע פעמים ושחזר את הסופרנאטנט סוף סוף.
התמצית הסופרנאטנטית או הגולמית שהתאוששה מכילה את מרכיבי הארס ומולקולות תאים אחרות כגון שומנים, פחמימות וחומצות גרעין. קבעו את ריכוז החלבון של התמצית הגולמית באמצעות ערכת בדיקה צבעונית מסחרית של ברדפורד. דגירה של הדגימות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מבלי לרעוד.
לאחר מכן, מדוד את הספיגה ב 595 ננומטר. שרטטו את הממוצעים של ספיגות BSA המדגם וקבעו את משוואת הגרף כאשר y הוא הספיגה, m הוא שיפוע הקו, x הוא ריכוז החלבון, ו-b הוא האורדינאט למקור. כדי לנתח את התמצית הגולמית, הוסיפו 30 מיקרוגרם של התמצית הגולמית לחמישה מיקרוליטרים של מאגר העמסת החלבון כדי לפרק את החלבונים.
הנפח הסופי חייב להיות פחות מ-50 מיקרוליטרים. הפעל אלקטרופורזה ב 25 milliamperes קבוע במשך שעה ו 30 דקות. כדי למנוע דיפוזיה של חלבוני הג'ל, הוסיפו את תמיסת הקיבוע לחלבונים ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות עם רעידות ב-80 סל"ד.
לאחר מכן, יש לנתק את התמיסה ולהוסיף את תמיסת הקישור הצולב של החלבון. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות ב-80 סל"ד. הסר את התמיסה ושטף את הג'ל עם 100 מיליליטר של מים מזוקקים במשך חמש דקות.
לאחר מכן, להסיר את המים ולחזור על הליך זה ארבע פעמים. בצע צביעת חלבון עם 50 מיליליטרים של תמיסה מסוננת Coomassie Brilliant Blue R-250 תוך ערבוב ב-60 סל"ד במתנד סיבובי במעבדה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוציאים מיליליטר דם אחד מהווריד הג'וגולרי של כבשה ומוציאים את המחט מהמזרק.
מיד לנקז דם לתוך צינור עם 50 מיליליטרים של תמיסת Alsever וצנטריפוגה ב 804 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את ה-supernatant ולהוסיף 30 מיליליטרים של תמיסת Alsever על ידי החלקתו לאורך הקירות הפנימיים של הצינור. לאט לאט החיזרו את הכדור באמצעות פיפטה מפלסטיק פסטר וצנטריפוגה שוב בתמיסה ב-804 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
חזור על הליך זה עד שיובהר הסופרנטנט. שמור על הנפח הסופי של תמיסת Alsever כדי להשיג ריכוז של 2 מיליון תאים למיליליטר בערך. לאחר מכן, השתמש בתא נויבאואר או בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.
דגירה של תערובות התמיסה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד ולאחר מכן צנטריפוגה של הצלחת ב-804 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שחזרו את הסופרנאטנט בצלחת נוספת של 96 בארות עם תחתית שטוחה. אם התמצית הגסה מכילה ציטוליסינים, אריתרוציטים ישקרו וישחררו המוגלובין.
קרא את הספיגה ב 415 ננומטרים וחשב את כמות התמצית המייצרת המוליזה ב 50% של אריתרוציטים. הגדל את כמות תמצית שושנת הים הגולמית ועצב את העלילה עם התאמות סיגמואידליות באמצעות תוכנה מתאימה. שטפו ביצת עוף אחת עם 1% SDS במים מזוקקים והפרידו את החלמון מחלבון הביצה בתנאים סטריליים.
הכינו פתרונות A, B, C ו-D.הוסיפו 500 מיקרוליטרים של פתרונות A ו-C לפתרון B ו-100 מיקרוליטרים של תמיסה D.ערבבו אותם ושפכו 25 מיליליטרים לכל צלחת פטרי. המתן עד שהתמיסה תתמצק בתנאים סטריליים ותיצור בארות בקוטר של כשני עד שלושה מילימטרים עם צינור דק. הוסיפו בסך הכל 20 מיקרוליטרים של בופר פוספט כבקרה שלילית בבאר אחת ו-20 מיקרוליטרים של פוספוליפאזה נחושה כבקרה חיובית בבאר אחרת.
מקם כמויות שונות של חלבון התמצית הגולמית 5, 15, 25, 35 ו-45 מיקרוגרם בבארות הנותרות, כל אחת בנפח סופי של 20 מיקרוליטרים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 שעות. התוצאות הייצוגיות של הפרוטוקול ששימש להשגת התמצית הגולמית של שושנת הים הראו כי שילוב שתי טכניקות, תסיסה ומחזורים של הקפאה והפשרה, יצרו פריקה יעילה של נמטוציסטים.
הנמטוציטים לפני ואחרי הגירויים מוצגים כאן. צינורית הנמטוציסט נחשפת בתמונה זו, מה שמעיד על שחרור הרעלן. הפרופיל האלקטרופורטי של תמצית גולמית של שושנת ים מוצג כאן.
תמצית שושנת הים הגולמית נותחה על ידי SDS-PAGE 15% ג'ל פוליאקרילאמיד והראתה חלבון מ-10 קילודלטון עד 250 קילודלטון במשקל מולקולרי. כאן, נתיב 1 הוא סולם החלבון ומסלול 2 הוא ארס שושנת ים. ציטוליסינים זוהו באזור המשקל המולקולרי של 15 קילודלטון ו-20 קילודלטון.
מוצג כאן בדיקת ההמוליזה באריתרוציטים מכבשים. הפעילות ההמוליטית של התמצית לפני ובמהלך מחזורי ההקפאה וההפשרה עלתה עד שהגיעו 100% המוליזה עם 50 מיקרוגרם מסך חלבון התמצית הגולמית בשני המחזורים האחרונים. הכמות הדרושה כדי לירות 50% אריתרוציטים כבשים היא 11.1 0.3 מיקרוגרם למיליליטר.
פעילות פוספוליפאזה זוהתה על ידי היווצרות הילות שקופות באזורים של צלחת האגר שבהם הוחלה דגימת התמצית הגולמית. התוצאות מראות נוכחות של פעילות פוספוליפאזה מתוך 15 מיקרוגרם של חלבון כולל. קוטר ההילה עלה באופן תלוי מינון;כלומר, אם כמות התמצית הגולמית עלתה, קוטר ההילה עלה.
תוך כדי ניסיון ההליך, הקפידו לגרום להפרקת נמטוציסטים, כמות החלבון הכולל, נתחו את התמצית הגולמית על ידי אלקטרופורזה של SDS-PAGE, חישבו את כמות חלבון התמצית הגולמית כדי לייצר 50% מההמוליזה, והשתמשו בכמויות שונות של חלבון בבדיקת פוספוליפאז. אנו יכולים לנתח את התמצית הגולמית על ידי טכניקה פרוטאומית כדי לזהות פוליפפטידים בעלי רלוונטיות רבה בביוטכנולוגיה ובביו-רפואה, אפילו ליצור פרופיל ולאפיין מולקולה ייחודית ולאחר מכן לייצר אותה במעבדה ליישום. השגנו חלק מהרצף של חלבון בעל ביצועים עם פעילות אנטי-סרטנית בתאי האפיתל של קרצינומה של הריאות האנושיות.
כמו כן, אנו מזהים את רצף הפוספוליפאזות בעלות העניין הביו-טכנולוגי.
