果蝇病毒感染的建立及宿主病毒相互作用分析

此方法可以帮助回答病毒宿主交互领域中有关如何有效建立嗜血杆菌黑色素病毒感染的关键问题。这种纳米注射方法允许精确控制病毒的感染剂量，并可以很容易地应用于与其他微生物病原体的感染。首先，每毫升生长1倍至第七个可行的S2星细胞，作为10厘米细胞培养皿中的松散、半粘附单层，10毫升完整的施耐德的果蝇培养皿，在25摄氏度下增加二氧化碳，一小时。

在孵育过程中，将刚解冻的果蝇C病毒或DCV重新暂停至0.01的多种感染，在一毫升完整的培养基中，并添加病毒溶液到细胞培养皿。然后将板返回25摄氏度的孵化器，为期三至五天。当细胞形态看起来模糊且培养基中充满了指示细胞碎片的黑色颗粒时，病毒即可采集。

在将整个细胞培养物转移到15毫升管中，在零下80摄氏度下对宿主细胞进行解合之前，通过移液将上一提液混合几次。为了产生病毒的工作浓度，在25摄氏度的水浴中解冻细胞悬浮液，在通过离心对细胞碎片进行造粒之前不断摇晃。然后将上流水液转移到一个新的无菌15毫升管中，用于涡流和每管高达200微升的病毒溶液。

为了确定平均病毒组织培养感染剂量，首先将10倍至5个S2星细胞在100微升中成8孔，每列12排96孔板。然后将板返回 25 摄氏度的培养箱。从零下80摄氏度的储存中随机选择五管病毒。

当细胞沉降时，用450微升无菌完整介质填充10个无菌1.5毫升微离心管，并将50微升病毒储存添加到含有450微升无菌完整介质的1.5毫升管中，每步稀释悬浮液10倍至第12井。在孵育结束时，在每根病毒管中，在每根培养的井中加入50微升，并将50微升无病毒的培养介质加入每列一井，作为负控制井。然后将板放在25摄氏度的培养箱中三天，并在光明场显微镜下以每天20倍的放大率评估每个病毒存量的细胞病变效应。

将细胞看起来模糊的井和介质中充满片段的井分类为正井和细胞形态正常为负井的井。在育种之前，将每毫升四环素的400微升50微克与4克新鲜标准玉米粉飞食彻底混合，将食物在4摄氏度过夜，蒸发乙醇。第二天早上，将食物加热至室温，将食物放入20只雌性及10只新圈养的雄性成年苍蝇放入繁殖小瓶中，在25摄氏度和60%的湿度下，在正常的光/暗循环下进行3至4天的繁殖孵化。

当有足够的卵子被下蛋后，在二氧化碳的轻流下收集新被封闭的成年苍蝇，再繁殖两次，就像刚刚证明的一样。经过三代四环素处理后，在二氧化碳的光流下收集五只苍蝇，用250微升的双蒸馏水和几根0.5毫米无菌陶瓷珠使苍蝇均匀。一分钟后，在样品中加入250微升2X缓冲器 A进行涡旋，然后将样品冻结在零下80摄氏度。

接下来，在25摄氏度的水浴中快速解冻零下80摄氏度储存的样品，随后在70摄氏度的水浴中孵育30分钟，然后提取基因组DNA，然后根据标准协议通过聚合酶链反应放大DNA。确认每只苍蝇中缺少沃尔巴契亚16小RNA和wsp，根据标准协议，通过凝胶电泳均质。然后，在标准玉米粉飞食上饲养无沃尔巴契亚苍蝇库存，如所证明的。

对于病毒感染，首先使用立体显微镜和薄钳将玻璃毛细针的尖端断裂到适当的直径进行纳米注射。要组装喷油器，请将天花板 O 形环和白色栅格放在喷油器的金属柱塞上，大酒窝朝外。使用装有 30 量针的注射器将玻璃针装满矿物油，然后将针头穿过衣领。

将较大的 O 环放在从针头钝端约一毫米的衣领底座周围，然后将针头安装到喷油器的柱塞上。将针头固定到柱塞上，然后按下空按钮，将微注射器的柱塞伸出来，直到听到声音信号。现在按填充以缩回柱塞五毫米，将针头浸入 100 个斑块形成单元病毒悬浮液中。

轻轻摇动一瓶或至少三瓶20沃尔巴奇亚无狼性雄性果蝇到注射盘上。雄性苍蝇在交配时优先，生殖可能会影响雌性。然后，在中索普勒拉和翼胸之间稍微浅的彩色区域注射每只苍蝇的50.6纳米色溶液，并测量细胞病变效应测定和从地面苍蝇定量RT PCR的DV负载，正如刚刚证明的。

注射后，小心地将苍蝇转移到新鲜的小瓶中，将小瓶放在水平位置，以防止苍蝇在麻醉中恢复时粘附在介质上。注射是耗时的，但DCV复制是非常快速的，所以是非常重要的写下确切的时间在管上，一旦所有的苍蝇从每个小瓶已经注射。病毒感染可诱发细胞解解，在感染后三天观察到细胞病变效应。

沃尔巴契亚 16s rRNA 和 wsp 底土器可用于检测沃尔巴奇亚和果蝇的存在，如证明。无沃尔巴奇亚苍蝇在DCV感染后以剂量依赖的方式表现出显著降低的存活率。DCV激活宿主中的抗病毒信号通路，这些通路对果蝇的抗病毒感染至关重要，而D者-2突变苍蝇的存活率下降和病毒载量增加就证明了这一点。

在尝试此程序时，重要的是要记住，与沃尔巴契亚基因型的污染可能会影响果蝇黑色素素蝇的易感性到DV感染。按照这个程序，其他方法，如更大规模的基因筛查可以执行，以回答有关病毒感染或抗病毒反应所需的未定义的宿主基因的其他问题。该技术开发后，为人类病毒病领域的研究人员探索果蝇黑色素病模型中地方性人类病毒感染爆发机制铺平了道路。

不要忘记，使用病毒可能非常危险，在执行此程序时，应始终采取预防措施，如佩戴适当的防护设备。