淋巴瘤组织学标本中多路荧光组织化学染色、成像与分析

淋巴瘤是组织学上复杂的肿瘤。因此，多路复用荧光免疫组织化学比传统的染色原免疫组织化学具有研究肿瘤细胞和微环境感兴趣的标记物的优点。这项技术有可能标准化组织性淋巴瘤样本中基于抗体的染色评分，由于肿瘤微环境的复杂性，这一过程在历史上一直具有挑战性。

具体来说，多路复用荧光免疫组织化学和光谱成像允许在一张幻灯片内定量测量多个污渍，从而允许评估临床材料中的抗原共表达和空间关系。首先将去蜡和补水滑梯浸入标准抗原检索缓冲器中，在微波炉中保存玻璃罐，并在合适的微波炉中执行热诱导表位检索。根据抗体在最后多路复用序列中的位置执行额外的微波剥离。

例如，第四个抗体在染色前需要三轮额外的微波剥离。剥离过程完成后，使用钳子和防热手套将滑梯在室温下转移到蒸馏水中至少冷却 10 分钟。当抗原检索溶液冷却后，用商业过氧化物酶块阻止组织过氧化物酶活性 10 分钟，然后用三分缓冲盐水（TBS）和非离子洗涤剂洗涤 5 分钟。

在阻断缓冲液中用10分钟的孵育阻断任何非特异性染色，然后用在室温下与感兴趣的主要抗体孵育30分钟，用TBS-D缓冲液进行3次5分钟洗涤。接下来，在室温下用适当的马萝卜过氧化物酶结合二次抗体孵育样品15分钟，随后在TBS-D缓冲液中进行三次洗涤，如证明。上次洗涤后，在幻灯片上应用适当的酪酰胺荧光试剂，在室温下孵育五分钟，然后进行三次五分钟 TBS-D 洗涤。

执行额外的微波剥离，以去除新鲜抗原检索溶液中的初级抗体和二级抗体，如所证明的。在检索结束时，用蒸馏水冷却幻灯片，然后用实验室湿巾将幻灯片上的区域干燥，无需纸巾。在室温下用dppy孵育幻灯片10分钟，然后进行三次TBS-D洗涤。

然后，用实验室湿巾小心干燥幻灯片，无需接触组织，然后用适当的安装介质安装样品以进行成像。对于单面幻灯片扫描，从用于标记样品的荧光波中选择适当的过滤器，并检查每个标记及其相应的荧光通道，以确定获得清洁信号的适当曝光时间，重点是应具有标记最强信号的组织组件。若要允许对像素强度进行交叉采样比较，请使用实时摄像机设置调整每个通道中的曝光时间，直到实时摄像机图像中没有曝光过度区域。

扫描所有幻灯片后，获取模拟的明亮场图像，以直观地与正常的免疫石化学模式进行比较，并确定染色模式是否正确。要扫描组织微阵列幻灯片，请使用成像系统中的组织微阵列扫描模式和适当的自动对焦算法。对于整个组织部分幻灯片，请由合格的病理学家检查幻灯片，从最具代表性的肿瘤区域选择最佳图像。

在开始分析之前，选择一个肿瘤标记来识别分析感兴趣的细胞。让病理学家检查图像，并决定是否需要组织分割。如果需要，请选择适当的控制区域进行分段，并检查图像分析软件能否正确识别这些区域。

细胞分割后，让病理学家检查分割图，以确保预期分割方法的保真度，并审查单个图像，以确定细胞分割是否足够，或者是否需要额外的组织分割来选择富集的肿瘤细胞、频闪和/或坏死的区域。然后与病理学家一起确定每个标记的光学强度正截止值，并在适当的统计软件程序中生成直方图，以分析每个细胞标记强度的频率分布。若要为定义的单元格中的特定感兴趣标记生成百分比数据，请在数据表中插入数据透视表并选择 Sum 以计算单个兴趣标记的积极性百分比。

将计算标记正单元格的总数除以总数。结果是标记正细胞百分比与一个核心，或一个研究编号。要生成数值数据，请获取样本中所有细胞研究中每个感兴趣标记的均值强度，以提取每个核心或研究编号的每个标记的中位数规范化计数。

在这里，显示了具有代表性的多路复用荧光免疫组织化学图像，用于具有c-MYC和BCL2基因重排的漫射大B细胞淋巴瘤样本。模拟亮场免疫组织化学图像展示了类似的肿瘤标记染色模式。多路复用荧光免疫组织化学图像在血管免疫细胞T细胞淋巴瘤中的T细胞面板上的应用揭示了肿瘤样本的细胞异质性。

此处显示了扁桃体控制样本的优化和结果数据分析。各种图像分析软件程序可以在解混步骤后，对肿瘤细胞和肿瘤微环境的标记表达和定位进行量化。这项技术为研究人员研究淋巴瘤单组织部分特定细胞类型中多个标记的共同表达铺平了道路。

注意在微摇步过程中防止热引起的伤害，并注意在甲板上执行的扫描步骤中的坠落风险。