الأورام اللمفاوية هي أورام معقدة من الناحية النسيجية. لذلك ، يوفر الكيمياء المناعية الفلورية متعددة الفلورسنت مزايا أكثر من الكيمياء المناعية التقليدية الملونة لدراسة علامات الاهتمام في الخلايا السرطانية و البيئة الدقيقة. هذه التقنية لديها القدرة على توحيد التهديف من الأجسام المضادة القائمة على تلطيخ في عينات الغدد الليمفاوية النسيجية، وهي العملية التي كانت تاريخيا تحديا بسبب تعقيد البيئة الدقيقة الورم.
على وجه التحديد، متعدد الفلوريسسينت المناعية والتصوير الطيفي يسمح القياس الكمي من بقع متعددة داخل شريحة واحدة، مما يسمح بتقييم التعبير المشترك المستضد والعلاقة الزبيسية داخل المواد السريرية. تبدأ من خلال غمر الشرائح دي مشمع وإعادة تهيئي في مخزن استرداد المستضد القياسية في جرة الزجاج حفظ الميكروويف وأداء الحرارة الناجمة عن استرجاع epitope في الميكروويف مناسبة. تنفيذ جولات إضافية من تجريد الميكروويف على أساس موقف الجسم المضاد في تسلسل متعدد النهائي.
على سبيل المثال، يتطلب الجسم المضاد الرابع ثلاث جولات إضافية من تجريد الميكروويف قبل تلطيخ. بعد الانتهاء من عملية تجريد، واستخدام ملقط وقفازات واقية من الحرارة لنقل الشرائح إلى الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على الأقل تهدئة. عندما يبرد محلول استرجاع المستضد ، قم بحظر نشاط بيروكسيديز الأنسجة مع كتلة بيروكسيديز التجارية لمدة 10 دقائق تليها غسل لمدة خمس دقائق في محلول ملحي مخزن بالتراين ، أو TBS ، ومنظفات غير أيونية.
كتلة أي تلطيخ غير محدد مع حضانة 10 دقيقة في منع العازلة تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وثلاثة خمس دقائق يغسل مع TBS-D العازلة. بعد ذلك ، احتضان العينات مع جسم مضاد ثانوي مناسب من الفجل peroxidase لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها ثلاثة يغسل في عازلة TBS-D كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، وتطبيق المشعاع التيراميد المناسبة القائمة على الشرائح لحضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة خمس دقائق TBS-D يغسل.
تنفيذ عملية تجريد إضافية على الموجات الدقيقة لإزالة الأجسام المضادة الأولية والثانوية في محلول استرجاع مستضد جديد كما هو موضح. في نهاية الاسترجاع، يبرد الشرائح في الماء المقطر ويجفف المناطق على الشرائح بدون أنسجة مع مناديل معملية. احتضان الشريحة مع dappy لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل TBS-D.
ثم، قم بتجفيف الشرائح بعناية باستخدام مناديل المختبر دون الاتصال بالأنسجة وقم بتركيب العينات مع وسيلة مناسبة للتصوير. بالنسبة لمسح الشريحة أحادية الضفير، حدد الفلاتر المناسبة من الفلوروفهورات المستخدمة في وضع العلامات على العينات وفحص كل علامة وقناة الفلورسينس المقابلة لتحديد وقت التعرض المناسب للحصول على إشارة نظيفة، مع التركيز على مكون الأنسجة الذي يجب أن يكون له أقوى إشارة للعلامة. للسماح بالمقارنة بين العينات بين كثافة البكسل، استخدم إعداد الكاميرا المباشرة لضبط وقت التعرض في كل قناة على حدة حتى لا تكون هناك مناطق مكشوفة في صورة الكاميرا المباشرة.
عندما يتم مسح جميع الشرائح، الحصول على صور حقل مشرق محاكاة لمقارنتها بصريا مع نمط المناعة الطبيعية وتحديد ما إذا كان نمط تلطيخ هو الصحيح. لمسح شرائح ميكروراي الأنسجة، استخدم وضع المسح الضوئي للميكروراي في نظام التصوير و خوارزمية التركيز التلقائي المناسبة. بالنسبة للشرائح المقطعية للأنسجة الكاملة، قم بمراجعة الشرائح من قبل أخصائي أمراض مؤهل لتحديد الصور المثلى من مناطق الأورام الأكثر تمثيلاً.
قبل البدء في التحليل، حدد علامة ورم لتحديد الخلايا التي تهم التحليل. واطلب أخصائي علم الأمراض مراجعة الصور وقرر ما إذا كان هناك حاجة إلى تجزئة الأنسجة. إذا لزم الأمر، حدد مناطق التحكم المناسبة للتجزئة وتحقق مما إذا كان برنامج تحليل الصور يمكنه التعرف على هذه المناطق بشكل صحيح.
بعد تجزئة الخلية، يكون أخصائي علم الأمراض مراجعة خريطة تجزئة لضمان دقة نهج التجزئة المقصود ومراجعة الصور الفردية لتحديد ما إذا كان تقسيم الخلية كافية أو إذا كان هناك حاجة إلى تقسيم الأنسجة إضافية لتحديد المناطق المخصب للخلايا السرطانية، stroma، أو نخر. ثم تحديد قيمة قطع كثافة الضوئية إيجابية لكل علامة بالاقتران مع الطبيب الشرعي وتوليد المدرج التكراري في برنامج الإحصاء المناسب لتحليل توزيع التردد من كثافة علامة لكل خلية. لإنشاء بيانات النسبة المئوية لعلامات معينة ذات أهمية داخل الخلايا المحددة، قم بإدراج جدول محوري في ورقة البيانات وحدد Sum لحساب النسبة المئوية للإيجابية لعلامة فائدة واحدة.
سيتم حساب العدد الإجمالي للخلايا الموجبة للعلامة مقسومًا على العدد الإجمالي. والنتيجة هي النسبة المئوية للنسبة المئوية للنسبة الإيجابية للخلية مع نواة واحدة، أو رقم دراسة واحد. لتوليد بيانات رقمية، الحصول على متوسط كثافة كل علامة الاهتمام في جميع الخلايا دراسة داخل عينة لاستخراج متوسط عدد تطبيع لكل علامة من كل رقم الأساسية أو الدراسة.
هنا، يتم عرض صور متعددة الفلورسنت مناعية متعددة الفلوريولوجية لعينة سرطان الغدد الليمفاوية B-الخلية الكبيرة المنتشرة مع c-MYC و BCL2 الجينات إعادة ترتيب. محاكاة مشرق مجال المناعة المناعة الصور تدل على نمط وصمة مماثلة علامة الورم. تطبيق الصور متعددة الفلورسنت المناعية الفلورية على لوحة الخلايا التائية في الأورام اللمفاوية الخلايا التائية angioimmunoblastic يكشف عن عدم تجانس الخلية من عينة الورم.
هنا، يتم عرض الأمثل لعينة التحكم اللوزتين وتحليل البيانات الناتجة. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من برامج تحليل الصور بعد الخطوة غير المحيرة إلى التعبير الكمي لعلامة وتوطين في الخلايا السرطانية والورم microenvironment. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لدراسة التعبير المشترك من علامات متعددة داخل أنواع خلايا محددة في أقسام الأنسجة المفردة من سرطان الغدد الليمفاوية.
الحرص على منع الإصابة الناجمة عن الحرارة أثناء خطوات microwaving وتكون على بينة من مخاطر السقوط أثناء خطوات المسح الضوئي التي يتم تنفيذها في سطح السفينة.
