I linfomi sono tumori istologicamente complessi. Pertanto, l'immunoistochimica fluorescente multiplexata offre vantaggi rispetto all'immunoistochimica cromogenica convenzionale per studiare marcatori di interesse nelle cellule tumorali e nel microambiente. Questa tecnica ha il potenziale per standardizzare il punteggio della colorazione a base di anticorpi in campioni di linfoma istologico, un processo che storicamente è stato impegnativo a causa della complessità del microambiente tumorale.
In particolare, l'immunoistochimica fluorescente multiplexata e l'imaging spettrale consentono la misurazione quantitativa di più macchie all'interno di un singolo scivolo, consentendo così la valutazione della coesposizione dell'antigene e della relazione spettrale all'interno del materiale clinico. Inizia immergendo le diapositive de-cerate e reidratate in un tampone standard di recupero dell'antigene in un barattolo di vetro a microonde e eseguendo il recupero dell'epitopo indotto dal calore in un forno a microonde adatto. Eseguire cicli aggiuntivi di stripping a microonde in base alla posizione dell'anticorpo nella sequenza multiplex finale.
Ad esempio, il quarto anticorpo richiede tre cicli aggiuntivi di stripping a microonde prima della colorazione. Dopo aver completato il processo di stripping, utilizzare le forcette e i guanti a prova di calore per trasferire gli scivoli in acqua distillata a temperatura ambiente per almeno 10 minuti di raffreddamento. Quando la soluzione di recupero dell'antigene si è raffreddata, bloccare l'attività della perossidasi tissutale con un blocco di perossidasi commerciale per 10 minuti seguito da un lavaggio di cinque minuti in soluzione salina tris-tamponata, o TBS, e un detergente non ionico.
Bloccare qualsiasi colorazione non specifica con un'incubazione di 10 minuti nel tampone di blocco seguita da incubazione con l'anticorpo primario di interesse a temperatura ambiente per 30 minuti e tre lavaggi di cinque minuti con tampone TBS-D. Successivamente, incubare i campioni con un anticorpo secondario coniugato di rafano perossidasi appropriato per 15 minuti a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi nel tampone TBS-D come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, applicare un reagente fluorescente appropriato a base di tiroide alle diapositive per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi TBS-D di cinque minuti.
Eseguire uno stripping aggiuntivo a base di microonde per rimuovere gli anticorpi primari e secondari nella soluzione di recupero dell'antigene fresco, come dimostrato. Al termine del recupero, raffreddare gli scivoli in acqua distillata e asciugare le aree sugli scivoli senza tessuto con salviette da laboratorio. Incubare lo scivolo con dappy per 10 minuti a temperatura ambiente seguito da tre lavaggi TBS-D.
Quindi, asciugare accuratamente le diapositive con salviette da laboratorio senza contattare i tessuti e montare i campioni con un mezzo di montaggio appropriato per l'imaging. Per la scansione a scorrimento monoplex, selezionare i filtri appropriati dai fluorofori utilizzati per etichettare i campioni ed esaminare ogni marcatore e il corrispondente canale di fluorescenza per identificare un tempo di esposizione adatto per ottenere un segnale pulito, concentrandosi sul componente tissutale che dovrebbe avere il segnale più forte per il marcatore. Per consentire il confronto tra campioni dell'intensità dei pixel, utilizzare l'impostazione della fotocamera dal vivo per regolare il tempo di esposizione in ogni singolo canale fino a quando non vi sono aree sovraesposte nell'immagine della fotocamera dal vivo.
Una volta scansionate tutte le diapositive, acquisire immagini simulate di campo luminoso da confrontare visivamente con il normale modello immunoistochimico e determinare se il modello di colorazione è corretto. Per scansionare diapositive di microarray tissutale, utilizzare la modalità di scansione del microarray tissutale nel sistema di imaging e un algoritmo di messa a fuoco automatica appropriato. Per le diapositive di sezione di tessuto intero, far rivedere le diapositive da un patologo qualificato per selezionare immagini ottimali dalle aree tumorali più rappresentative.
Prima di iniziare l'analisi, selezionare un marcatore tumorale per identificare le cellule di interesse per l'analisi. Chiedere a un patologo di rivedere le immagini e decidere se è necessaria la segmentazione dei tessuti. Se necessario, selezionare le aree di controllo appropriate per la segmentazione e verificare se il software di analisi delle immagini è in grado di identificare correttamente tali aree.
Dopo la segmentazione cellulare, chiedere al patologo di rivedere la mappa di segmentazione per garantire la fedeltà dell'approccio di segmentazione previsto e rivedere le singole immagini per determinare se la segmentazione cellulare è adeguata o se è necessaria una segmentazione dei tessuti aggiuntiva per selezionare le regioni arricchite per cellule tumorali, stroma e o necrosi. Quindi determinare il valore di taglio positivo dell'intensità ottica per ogni marcatore in combinazione con il patologo e generare istogrammi in un programma software statistico appropriato per analizzare la distribuzione della frequenza dell'intensità del marcatore per cella. Per generare dati percentuali per marcatori di interesse specifici all'interno di celle definite, inserire una tabella pivot nel foglio dati e selezionare Somma per calcolare la percentuale di positività di un singolo marcatore di interesse.
Verrà calcolato il numero totale di cellule positive marcatori divise per il numero totale. Il risultato è la percentuale di cellule positive del marcatore con un nucleo o un numero di studio. Per generare dati numerici, ottenere l'intensità media di ogni marcatore di interesse in tutte le cellule studiate all'interno di un campione per estrarre il conteggio mediano normalizzato per ogni marcatore di ogni nucleo o numero di studio.
Qui vengono mostrate immagini immunoistochimiche fluorescenti multiplex rappresentative per un campione diffuso di linfoma a grandi cellule B con riarrangiamento genico c-MYC e BCL2. Le immagini immunoistochimiche simulate sul campo luminoso dimostrano un simile modello di colorazione dei marcatori tumorali. L'applicazione di immagini immunoistochimiche fluorescenti multiplex a un pannello di cellule T nei linfomi angioimmunoblastici a cellule T rivela l'eterogeneità cellulare del campione tumorale.
Qui vengono mostrate l'ottimizzazione di un campione di controllo delle tonsille e l'analisi dei dati risultante. Una varietà di programmi software di analisi delle immagini può essere utilizzata dopo il passaggio di unmixing per quantificare l'espressione del marcatore e la localizzazione nelle cellule tumorali e nel microambiente tumorale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare la coezione di marcatori multipli all'interno di specifici tipi cellulari in singole sezioni tissutali di linfoma.
Fare attenzione a prevenire lesioni indotte dal calore durante le fasi di microwaving ed essere consapevoli dei rischi di caduta durante le fasi di scansione eseguite nel ponte.
