عضويات الكلى المستزرعة في المختبر لا تزال غير ناضجة ، مما يحد من قابليتها للتطبيق. وهذه الطريقة في الزرع داخل الأوعية الدموية تحفز الأوعية الدموية وتعزز نضوج الكائنات العضوية. الإجراء فعال للغاية ، مما يسمح بزرع وتحليل عدد كبير من الكائنات العضوية في تجربة واحدة.
بعد تحضير عضويات الكلى المشتقة من HIPSC واحتضان بيض leghorn المخصب ، قم بإنشاء نافذة في قشر البيض في اليوم الثالث من الحضانة. ضع قطعة صغيرة من الشريط الشفاف على الطرف المدبب للبيضة. اصنع ثقبا صغيرا في قشر البيض في منتصف الشريط الشفاف عن طريق النقر عليه بنهاية حادة لزوج من مقص التشريح.
بعد ذلك ، أدخل إبرة قياس 19 على حقنة سعة خمسة ملليلتر في الفتحة بزاوية 45 درجة. نضح ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من الألبومين من البويضة لخفض الجنين داخل البيضة. قم بإخفاء الفتحة بقطعة ثانية من الشريط الشفاف ، ثم ضع قطعة كبيرة من الشريط الشفاف على القلم الرصاص المحدد لأعلى الجانب المواجه لأعلى من البيضة.
اصنع ثقبا في قشر البيض في منتصف الشريط الشفاف عن طريق النقر عليه بنهاية حادة لزوج من مقص التشريح. قطع نافذة دائرية صغيرة في قشر البيض من هذه الحفرة باستخدام مقص تشريح منحني. انظر من خلال هذه النافذة لتحديد موقع الجنين.
ثم قم بتكبير النافذة لتحسين الوصول إلى الجنين. قم بإزالة أي قطع كبيرة من قشر البيض قد تكون سقطت فوق الجنين باستخدام ملقط. قم بإزالة القطع الصغيرة عن طريق وضع بضع قطرات من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم على الجنين باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، ثم استنشاق DPBS مع قشر البيض في الماصة.
باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، أضف ثلاث قطرات من DPBS ، تستكمل مع 0.5 ٪ البنسلين الستربتومايسين إلى البيضة. أغلق النافذة بعناية بقطعة كبيرة من الشريط الشفاف قبل وضع البويضة مرة أخرى في الحاضنة حتى اليوم الرابع من الحضانة. قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني.
ضع البيضة تحت مجهر تشريح على حامل مطاطي أو كرتون بيض. جنين الدجاج الآن في مرحلة هامبرغر هاميلتون من 23 إلى 24 وملقى على جانبه الأيسر وجانبه الأيمن مواجه للمشاهد. حدد موقع الجناح الأيمن وبرعم الساق للجنين حيث سيتم تقييم coelom بين هذين البرعمين الطرفين.
في المنطقة الواقعة بين الجناح الأيمن وبرعم الساق ، قم بإنشاء فتحة متتالية في غشاء vitelline ، والمشيمة ، والسلى عن طريق إمساكها بزوجين من ملقط التشريح وسحبها برفق في اتجاهين متعاكسين. تحقق مما إذا كان هناك وصول دون عائق إلى التجويف القولوني. أمسك برفق بحافة جدار الجسم بين الجناح وبرعم الطرف بزوج من ملقط التشريح واسحبه قليلا نحو المشاهد.
يجب أن يكون تجويف coelomic مرئيا بوضوح. أدخل بعناية أداة حادة ولكن رفيعة في تجويف coelomic. ضع نصف عضوي داخل البيضة فوق الألانتوا باستخدام تشريح الجافية.
باستخدام ملقط التشريح ، أمسك بعناية بحافة جدار الجسم واسحبها قليلا نحو المشاهد لجعل فتحة الكويلوم مرئية. حرك العضو العضوي برفق نحو ومن خلال الفتحة الموجودة في جدار الجسم إلى الكويلوم باستخدام سلك تنغستن غير حاد وحامل مشرط صغير. ادفع العضو العضوي قليلا إلى الجمجمة لتثبيته داخل الكويل.
يمكن رؤيته الآن خلف برعم الجناح مباشرة. أضف ثلاث قطرات من DPBS إلى البيضة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية. أغلق النافذة بعناية بقطعة كبيرة من الشريط الشفاف قبل وضع البويضة مرة أخرى في الحاضنة حتى اليوم 12 من الحضانة.
قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني. ضع البيضة تحت مجهر تشريح في حامل مطاطي. تقييم الأوعية الدموية وتحديد الأوردة ، والتي يمكن تمييزها عن الشرايين بلونها الأحمر الأكثر إشراقا قليلا.
لتحسين الوصول إلى الأوعية الدموية ، قم بتكبير النافذة بعناية عن طريق قصها بمقص تشريح منحني. بعد اختيار الوريد ، أدخل طرف الإبرة الشعرية الدقيقة في الوريد بزاوية من صفر إلى 20 درجة. تأكد من وجود الإبرة في الوريد عن طريق تحريك الطرف برفق من جانب إلى آخر.
نفخ بلطف وثبات في نظام الحقن لحقن عدسة كوليناريس agglutinin. ضع البيضة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 دقائق للسماح لها بالدوران. ضع البيضة في حامل مطاطي على المقعد.
ثم ، قطع الأغشية المحيطة بالجنين بمقص تشريح منحني. اغرف الجنين من البيضة بملعقة مثقبة وقطع رأس الجنين على الفور باستخدام المقص. تحت مجهر التشريح ، ضع جسم الجنين في طبق بتري.
ضع الجنين على ظهره في طبق بتري وانشر أطرافه. افتح بعناية جدار البطن للجنين على طول المحور الطولي باستخدام ملقط. حدد موقع العضو العضوي داخل الجنين.
غالبا ما يصبح العضو العضوي مرتبطا بفص الكبد الأيمن ، إما عند طرف التدليل أو في الجمجمة ، أسفل القفص الصدري مباشرة. لذلك ، من المستحسن أن تبدأ بالنظر إلى هذه المواقع. بمجرد تحديد موقع العضو العضوي ، قم بإزالته من الجنين عن طريق قطعه بمقص صغير.
ضع العضو العضوي في أنسجة الدجاج التي تعلق عليه حتما في طبق بتري تحت مجهر التشريح. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من مناديل الدجاج باستخدام شفرة حلاقة ذات حدين من الفولاذ المقاوم للصدأ. تحتوي الصور المناعية الفلورية لعضو الكلى غير المزروع والعضو العضوي الكلوي المزروع على هياكل كبيبية وأنبوبية.
في الكائنات العضوية غير المزروعة ، توجد بعض الخلايا البطانية البشرية. في العضو العضوي المزروع ، تظهر شبكة الأوعية الدموية المثقوبة في جميع أنحاء العضو العضوي. توضح الصور المكبرة للمناطق المحاصرة الأنواع الثلاثة للخلايا البطانية التي يمكن تمييزها في الكائنات العضوية المزروعة: الخلايا البطانية البشرية المثقوبة ، والخلايا البطانية البشرية غير المثقوبة ، والخلايا البطانية المشتقة من الدجاج.
في الكائنات العضوية غير المزروعة ، تحيط الخلايا البطانية بالهياكل الكبيبية ولكنها لا تغزوها. ومع ذلك ، في الكائنات العضوية المزروعة ، يتم الأوعية الدموية للهياكل الكبيبية بواسطة الشعيرات الدموية المثقوبة. يمكن تحليل المواد العضوية المزروعة باستخدام تقنيات مختلفة اعتمادا على الهدف من التجربة.
يمكن أن توفر المقارنة المباشرة مع الضوابط غير المزروعة نظرة ثاقبة لعملية الأوعية الدموية والنضج.
