في هذا الفيديو، سوف نظهر كيفية قياس تحويل AAV في شبكية العين الماوس باستخدام طريقة PCR قطرة الرقمية، وهو أمر حساس للغاية ويفعل القياس الكمي المطلق للحمض النووي الهدف. لقد طورنا هذه الطريقة بشكل رئيسي لبنى AVV الكبيرة التي لا تسمح لنا باستخدام جين مراسل مثل البنى المستندة إلى CRISPR. باستخدام هذه الطريقة، يمكننا ببساطة تحديد معدل نقل AAVs في شبكية العين.
تعتمد هذه الطريقة على الحساسية والتحديد الكمي المطلق ل PCR القطيرات الرقمية وتسفر عن نتائج مباشرة إلى الأمام. في هذا الفيديو، سوف نظهر كيفية قياس تحويل AAV في شبكية العين الماوس باستخدام طريقة PCR قطرة الرقمية، وهو أمر حساس للغاية ويفعل القياس الكمي المطلق للحمض النووي الهدف. لقد طورنا هذه الطريقة بشكل رئيسي لبنى المنطقة الكبيرة التي لا تسمح لنا باستخدام جين مراسل مثل البنى القائمة على CRISPR.
باستخدام هذه الطريقة، يمكننا ببساطة تحديد معدل نقل AAVs في شبكية العين. تعتمد هذه الطريقة على الحساسية والتحديد الكمي المطلق ل PCR القطيرتين وتسفر عن نتائج مباشرة إلى الأمام. وبسبب كفاءة منهجية PCR القطيرات الرقمية، فإن العديد من المختبرات تتحول بالفعل من PCR الكمي في الوقت الحقيقي إلى PCR القطيرات الرقمية أو AAV titrating.
يمكن أن توفر هذه الطريقة أيضا أساسا للقياس الكمي للحمض النووي الميتوكوندريا في شبكية العين ، بالإضافة إلى التحقق من كفاءة تصحيح الطفرة القائم على CRISPR للعلاج الجيني في شبكية العين الماوس. إعداد خليط العدوى مع مساعد AAV plasmid، AAV capsid plasmid، AAV ناقلات، والحل PI في خمسة ملليلتر الطلب. أضف خليط العدوى المعدة بالملليلتر الخمسة إلى وسائط الثقافة.
احتضان الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية. جمع وسائل الإعلام في 48 إلى 60 ساعة بعد transfection. هضم الوسائط مع DNAs بتركيز نهائي قدره 250 وحدة لكل ملليلتر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وطارد مركزي عند 4000 غرام أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
قبل الرطب غشاء السليلوز المجددة مع برنامج تلفزيوني. تصفية وسائل الإعلام مع 0.22 ميكرومتر مرشح حقنة في غشاء السليلوز المجددة قبل الرطب لمدة 100 كيلو دالتون. الطرد المركزي غشاء السليلوز المجددة في 4، 000 G أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة والتخلص من وسائل الإعلام.
غسل والطرد المركزي غشاء السليلوز المجددة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.001٪ pluronic F68 ثلاث مرات في 4000 G أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. جمع AAVs المركزة من الجزء العلوي من غشاء السليلوز المجددة وتخصيص لمزيد من الاستخدام. هنا أظهرنا كيفية جعل أصغر نطاق إنتاج AAV.
بعد فحص هذا البروتوكول، يجب أن تكون قادرا على صنع مركبات مضادة للمركبات كافية لرؤية تعبير المراسل في شبكية العين. يمكنك أيضا اتباع البروتوكول لPCR الرقمية لتكون قادرة على titer AAVs الإنتاج. تطبيق قطرة واحدة من 0.5٪ تروبيكاميد و 2.5٪ هيدروكلوريد الفينيليفرين التي تحتوي على قطرة العين قبل التخدير لتوسيع التلاميذ.
تخدير الفئران مع isoflurane والتحقق من ردود الفعل. تطبيق 0.3٪ tobramycin و 0.1٪ ديكساميثازون محلول العيون العقيم قطرة العين إلى كل عين قبل إجراء الحقن. استخدم الخطاف الجراحي لتثبيت الجفن العلوي.
سحب قليلا إلى الوراء لفضح الجزء الظهري من العين. الشريط هوك إلى الفرقة لعقد في الموقف. إزالة الملتحمة مع مقص القزحية المنحنية لفضح تصلب العين.
استخدام حقنة الأنسولين 30G الطازجة والمعقمة لثقب الصلبة. أدخل إبرة الحقنة الدقيقة من خلال نفس الثقب باستخدام المتلاعب الدقيق. ضع طرف الإبرة خلف العدسة في منتصف كوب العين.
حقن لتر واحد صغير من محلول AAV ببطء في الزجاجية للعين. اترك الإبرة في مكانها لمدة دقيقة واحدة وسحب الإبرة ببطء. تطبيق المضادة للالتهابات ومضادة للبكتيريا العلاج هلام موضعي يحتوي على 0.3٪ tobramycin و 0.1٪ ديكساميثازون إلى كأس العين.
تطبيق قطرة واحدة قبالة 0.5٪ تروبيكاميد. و2.5٪ فينيليفرين هيدروكلوريد تحتوي على قطرة العين قبل التخدير لتوسيع التلاميذ. تطبيق كارباميد اثنين ملليغرام لكل غرام هلام موضعي على سطح العينين.
ضبط موقف الماوس حسب الحاجة إلى مركز العين الماوس. إجراء التصوير fundus وفلورسينس على كلتا العينين لمتابعة التعبير TdTomato أسبوع واحد وأسبوعين بعد الحقن داخلفيتريال. قتل الحيوانات باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون قبل الإجراء.
تحول الكرة العين إلى الأمام مع مساعدة من ملقط مقسم 13.5 سم. إزالة العدسة جنبا إلى جنب مع بقايا الزجاجية. قطع اتصال مقلة العين إلى العصب البصري مع ملقط منحني الدقة والضغط بلطف شبكية العين مع نفس ملقط منحني.
عزل الحمض النووي الجينومي مع البروتين K تسويقها هضم مجموعة الحمض النووي الجينوم الأنسجة القائمة على الفيلم. هضم شبكية العين في 55 درجة مئوية 200 G لمدة 30 دقيقة مع بروتيناز K.Lyse شبكية العين تماما واتبع sprotocol الشركة المصنعة. في هذه البروتوكولات، أظهرنا الحقن داخل الفيتريال فوندوس التصوير فلوريسنس، فضلا عن شبكية العين وعزل الحمض النووي الجينومي.
هذه إجراءات حاسمة جدا لشبكية العين، واتباع هذا البروتوكول، يجب أن تكون قادرة على حقن AAVs المنتجة ومتابعة ملف تعريف التعبير الخاصة بهم. ومغرفة أن كفاءة النقل عن طريق تحديد كميا الجينوم AAV في الحمض النووي الجينوم الشبكية. هنا ، يمكنك أن ترى التطبيق الأساسي للPCR قطرة الرقمية ، حيث يمكنك جعل التحديد الكمي المطلق للجينوم AAV التي تنقل في خلايا الشبكية.
تمييع DNAs الجينوم من شبكية العين عن طريق الحقن في 0.05٪ pluronic F 68 حل للوصول إلى تركيز نهائي من نانوغرام واحد لكل ميكرولتر لكل عينة. أداء توليد قطرة في مزيج رد فعل PCR 20 ميكرولتر، بما في ذلك واحد نانوغرام الحمض النووي الجينومي 125 الجسيمات النانوية التمهيدية و2X مزيج سوبر دائمة الخضرة. قم بتحميل مزيج العينة إلى الجزء الأوسط من الخرطوشة لتوليد القطيرات.
بعد ذلك إضافة 70 ميكرولتر توليد قطرة النفط في الصف السفلي من خرطوشة. ضع طوقا على رأس خرطوشة. تأكد من عدم وجود فجوة بين طوقا وخرطوشة.
ثم وضعه في مولد قطرة. تأخذ بلطف ما يقرب من 40 ميكرولتر من قطرات التي يتم إنشاؤها في الجرس العلوي. إضافة حل قطرات إلى نصف التفاف 96-حسنا لوحة رد فعل PCR.
ختم لوحة PCR مع جهاز ختم لوحة PCR باستخدام رقائق ختم الألومنيوم. ضع لوحة PCR في دورة حرارية مختومة بحرارة 96 بئرا. استخدم بروتوكول ddPCR المشار إليه في المقالة.
ضع لوحة PCR في قارئ القطرات لتحليل البيانات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرا على تنفيذ تقنية PCR الرقمية الأساسية. يمكنك أيضا استخدام الخلايا التي تمارس مع كميات صغيرة من المواد، وهو مثالي لتقنية PCR الرقمية.
ومع ذلك، يجب ضبط بعناية كمية الحمض النووي الهدف لا تتجاوز الحد الأقصى لPCR قطرة الرقمية. هنا مخطط التدفق للإجراء التجريبي. قمنا بإنتاج AAV على نطاق صغير ، يليه تأليه AAV.
ثم قمنا بالحقن داخل الفيتريال. بعد ذلك ، قمنا بقياس كثافة الفلورسنت عن طريق التصوير الفلوري fundus. ثم عزل شبكية العين الماوس واستخراج الحمض النووي الجينومي من شبكية العين لddPCR.
Titering AAV أمر بالغ الأهمية أيضا لتكون قادرة على قياس صحيح AAV النقل. ddPCR يعتمد على جيل من قطرات التي تمييع الهدف AAV genom. تظهر نتائج ddPCR التمثيلية قطرات إيجابية وسلبية لجينوم AVV.
موجب فوق العتبة و سالب هو أدناه. بعد التكاثر مع عوامل التخفيف ، تم العثور على titer من AAVs أن يكون 10 إلى 12 في نسخ الجينوم لكل ملليلتر. من أجل تحديد كفاءة نقل AAV بشكل صحيح ، تم حقن العديد من شبكية العين.
تم تصوير الحيوانات المحقونة، وتم حساب متوسط الكثافة الفلورية. في غضون أسبوعين، تم عزل شبكية العين. وتم تنفيذ ddPCR باستخدام WPRE و 18 التمهيديات S.
ارتبطت كثافة الفلورية لشبكية العين المحقونة AAV بحسابات جينوم AAV ، مما يدل على قوة المنهجية. هنا، أظهرنا العديد من التقنيات، بما في ذلك على نطاق صغير AAV إعداد الحقن داخلفيتريال.
