تسمح هذه الطريقة للتصوير في الجسم الحي لخلايا الشبكية بإجراء فحوصات لأمراض العيون وفهم الوظائف الطبيعية لشبكية العين. توفر هذه الطريقة نهجا مباشرا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة للتصوير في الجسم الحي لشبكية العين بواسطة الفحص المجهري ثنائي الفوتون. يعد تثبيت الماوس بشكل صحيح أمرا أساسيا للحصول على الجودة في صور الجسم الحي.
تدرب على وضع الماوس في حامل الرأس ، وكن مرتاحا للإجراء قبل محاولة الحصول على الصور. تخدير الحيوان وفقا لبروتوكول استخدام الحيوانات المعتمد. ضع محلول توسيع حدقة العين ، واترك الماوس في الظلام لمدة خمس دقائق للسماح للتلاميذ بالتوسع.
ثبت دبوس قناة الأذن السفلية في الوضع الممتد للداخل ودبوس قناة الأذن العلوي في الوضع المسحوب. قم بتدوير الذراع الرئيسي لحامل الرأس حتى يميل قضيب سماعة الأذن بزاوية 60 درجة أسفل الأفقي. مع مواجهة الماوس لقضيب العض ، قم بتركيب أذن واحدة على الدبوس السفلي الممتد مع إدخال الدبوس في قناة الأذن.
بعد فك المسمار الذي يثبت دبوس قناة الأذن العلوي ، قم بتمديد الدبوس إلى قناة الأذن الأخرى ، وأعد ربط المسمار لتأمين الرأس. تأكد من أن الماوس آمن في حامل الرأس. اضغط لأسفل على الجزء العلوي من الرأس.
يجب أن يبقى الماوس بشكل آمن في قضبان الأذن ، ويجب أن يدور رأسه بحرية حول محور قنوات الأذن. مع وضع شريط العض باتجاه رأس الماوس ، ارفع رأس الماوس برفق للسماح بخفض قواطع الفك العلوي في حامل قضيب العض ، واسحب قضيب العضة بقوة لطيفة لتأمين الرأس. استخدم المسمار لتثبيت قضيب العض في موضعه ، وضع الماوس والحامل على مسرح المجهر.
ضع قطرات تشحيم للعين على كلتا عيني الماوس. قم بتدوير الذراع الرئيسي لحامل الرأس حتى يتم توجيه بؤبؤ عين واحدة بما يتماشى مع مسار الضوء ، وضع غطاء رقم 1.5 في حامل المرشح المضغوط. بعد تثبيت الحامل في مرحلة المجهر ، قم بخفض الغطاء حتى يلامس جل العين المزلق دون لمس القرنية ، واضبط المرحلة في البعد X-Y وموضع Z الموضوعي حتى يغطي ضوء الإثارة واسع المجال القرنية بالكامل.
استخدم العدسة لمواصلة ضبط موضع Z حتى يتم التركيز على الخلايا أو الهياكل الفلورية في شبكية العين ، مما يزيد من إضاءة epifluorescence حسب الضرورة لحل الخلايا الفردية أو الهياكل ذات الأهمية. ضبط محاذاة شبكية العين مع مسار ضوء التصوير. اضبط زاوية الرأس حتى يحدث تمدد أو تقلص للضوء خارج نطاق التركيز البؤري فقط عند تغيير المستوى البؤري، مما يقلل من تشوهات X-Y.
بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل مصباح epifluorescence ، وأغلق مصراع الإضاءة. للتصوير ثنائي الفوتون ، اتبع جميع بروتوكولات أمان الليزر المؤسسية. قم بإيقاف تشغيل وتغطية كل الضوء المحيط ، وقم بتبديل مسار ضوء الإثارة إلى الليزر ومسار ضوء الانبعاث إلى PMTs.
في برنامج الحصول على الصور ، اضبط حجم الإطار على 512 × 512 ومتوسط الإطار على ثلاثة. اضبط خطوة Z للبدء من أعلى المكدس والتقدم لأسفل ، مما يقلل من تنشيط الليزر ثنائي الفوتون للمستقبلات الضوئية. قم بتشغيل وتمكين PMTs ، واضبط الجهد على 680 فولت.
تمكين مصاريع التصوير والانبعاثات. ابدأ معاينة صورة مباشرة للنسيج المستهدف ، بدءا من طاقة ليزر 1٪ ، واضبط سطوع الشاشة تلقائيا لتصور الخلايا أو الهياكل ذات الاهتمام. إذا كانت الأنسجة المستهدفة قاتمة أو غير واضحة ، فقم بزيادة نسبة طاقة الليزر حتى تصبح الهياكل مرئية دون تجاوز 45 ملي واط.
قم بمناورة مرحلة المجهر في اتجاه X-Y للتركيز على منطقة التصوير المطلوبة ، وانتقل إلى المستوى Z مع التركيز على الهياكل ذات الاهتمام. بالنسبة لتجربة الفاصل الزمني المزمن ، افتح صورة تم الحصول عليها مسبقا لاستخدامها كمرجع للخلايا محل الاهتمام ، مع الحرص على أن تكون زاوية التصوير في الصورة الحالية مشابهة لزاوية الصور السابقة. بعد ذلك ، انتقل إلى مستويات Z العلوية والسفلية ذات الأهمية لتعيين حدود Z لمكدس التصوير والحصول على الصورة.
عندما يتم الحصول على جميع الصور ، قم بتعطيل PMTs ومصراع الليزر. قم بتبديل مسار ضوء الإثارة إلى إضاءة epifluorescence ومسار ضوء الانبعاث مرة أخرى إلى العدسة. بعد ذلك ، قم بإنهاء برنامج الحصول على الصور ، وقم بإيقاف تشغيل الليزر في واجهة الكمبيوتر ، وقم بإيقاف تشغيل الجهاز بترتيب بدء التشغيل العكسي ، باستثناء الجهاز الذي يعمل دائما.
في نهاية التحليل ، أخرج الماوس من حامل الرأس ، واستخدم منديلا خاليا من النسالة لإزالة جل العين برفق. بعد ذلك ، ضع مرهم العين المزلق على كلتا العينين ، وضع الماوس على وسادة تسخين دوارة بالماء الدافئ 37 درجة مئوية مع المراقبة حتى الاستلقاء الكامل ، قبل إعادة الماوس إلى غلافه. في فئران VGlut-2-Cre ، يمكن تمييز سومات الخلايا العقدية الشبكية بوضوح وغالبا ما تكون الحزم المحورية واضحة.
يسهل مسار المحاور العصبية والصورة السلبية للأوعية الدموية تحديد رأس العصب البصري في الفئران VGlut-2-Cre ، وهو أمر مفيد كمعلم في تجارب التصوير المزمن. على عكس خلايا العقدة الشبكية ، غالبا ما يتم ملاحظة الخلايا العصبية لخلايا amacrine في طبقات الضفيرة الداخلية. بعد يوم واحد من حقن NMDA داخل العين ، تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين عمليات قصيرة أو مورفولوجيا أميبية وفقا للتقارير السابقة.
يؤدي توصيل صبغة إيفانز الزرقاء عن طريق حقنة واحدة داخل الصفاق قبل 30 إلى 60 دقيقة من التصوير إلى وضع علامات قوية على الأوعية الدموية المنبثقة من رأس العصب البصري والتي تستمر لمدة سبعة أيام على الأقل. بعد التثبيت ، يمكن قياس المسافة الحقيقية بين أزواج الخلايا داخل حوامل شبكية مسطحة كاملة في عمليات مسح متحدة البؤر ومطابقتها مع مسافات البكسل في الجسم الحي لتحديد متوسط حجم البكسل للصور في الجسم الحي. تسمح الكريات المجهرية الفلورية المحقونة في عيون الفئران بقياس قطر الكرة المجهرية في الجسم الحي ، مما يعطي تقديرا أكبر قليلا لحجم البكسل ولكن مع مزيد من التباين.
يمكن إقران التصوير في الجسم الحي بالتحليلات النسيجية مثل التلوين المناعي والتهجين في الموقع. يمكن لهذه الطرق تحديد أنواع معينة من الخلايا وفحص التعبير الجيني للخلايا المصورة.
