هذا البروتوكول مهم لأنه يصف نموذجا لعدوى الجرح Aeruginosa Pseudomonas المزمنة دون الحاجة إلى زرع المواد الأجنبية أو قمع المناعة. تأخر التلقيح مع Pseudomonas aeruginosa 24 ساعة بعد كامل سمك جرح الختان pros الإزالة السريعة ونشر البكتيريا ، مما يشكل العدوى التي تستمر من سبعة إلى 10 أيام. هذا النموذج الفريد سيكون أداة مفيدة للتحقيقات من التسبب البكتيرية, التفاعلات الممرض المضيف, وتطوير علاجات جديدة لالتهابات الجرح Aeruginosa Pseudomonas المزمنة.
سيساعدني في مظاهرة من الإجراء سيكون دان ليو، وهو طالب طب من مختبر بوليكي. قبل البدء في الإجراء، وزن الماوس من العمر من ثمانية إلى 12 أسبوعًا، للحصول على وزن أساسي ووضع الماوس في موضع عرضة. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس، حقن تحت الجلد الماوس مع 250 ميكرولترات من قبل الدافئة معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم على كل جناح.
استخدم آلة حلاقة كهربائية لإزالة الشعر من منطقة الظهر من الفأرة وطبق طبقة رقيقة من كريم إزالة الشعر على الجلد المكشوف. بعد 20 إلى 60 ثانية، وإزالة الشعر ومستحضرات محلول الزائدة مع الشاش مبللة في الماء الدافئ. لجراحة الجرح الختاني سمك كامل، استخدم أولا إبرة قياس 25 لحقن تحت الجلد 0.6 إلى ملليغرام واحد لكل كيلوغرام من buprenorphine الإفراج المستمر في منطقة منتصف الظهر من الماوس ومسح الموقع الجراحي بطريقة دائرية مع ثلاثة بيتادين عقيمة بديلة ومسحات الكحول.
وضع البلاستيك التشبث التفاف الستائر على موقع الجراحة وتمتد الجلد مشدود caudally. عندما يجف الجلد، استخدم معقمة 6 ملليمتر قطر جلد خزعة لكمة لجعل شق أولي من خلال البشرة الظهرية اليسرى، تليها شق ثان على البشرة الظهرية اليمنى. استخدام ملقط خيمه الجلد من وسط منطقة الجرح المبينة على اليسار واستخدام مقص لإخراج البشرة وطبقات الجلد.
بعد تكرار الشق على منطقة الجرح المحددة على اليمين لخلق الجروح الختانية المتناظرة، وغسل كل من الجروح مع 50 ميكرولترات من المالحة العقيمة. عندما يكون الموقع الجراحي والجلد المحيطة بها قد جفت، وتغطي الجروح والضلم مع صلصة فيلم شفاف ووضع الماوس في قفص نظيف على وسادة التدفئة مع مراقبة حتى إعادة شغل كامل. بعد 24 ساعة من الجراحة، وزن الماوس المُعاد تخديره مرة أخرى وحقن الحيوان تحت الجلد بـ 250 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم قبل الدافئة 0.9٪ في كلا الجناحين.
المقبل, تحميل 100 ميكرولترات من تعليق سلالة P.aeruginosa الإنارة في 500 ميكروليتر قبعة سقف سلامة حقنة مجهزة بإبرة قياس 27 وحقن 40 ميكرولترات من تعليق البكتيريا من خلال خلع الملابس فيلم شفافة في كل جرح. تأكد من أن التعليق البكتيري مختلط بشكل جيد وأن الضمادات الشفافة سليمة. تأكد من أن تثقب الملابس الشفافة مرة واحدة فقط مع جانب الإطار الإبرة.
ثم العودة إلى قفص الماوس على صفحة التدفئة مع رصد وتوفير معجون الغذائية عالية السعرات الحرارية تقع بين الكريات الغذائية على أرضية القفص. لوحة inoculum المتبقية على لوحة LB أجار والعد المستعمرات لتأكيد عدد البكتيريا التي تم تدار. لفي التصوير في الجسم الحي من الجروح المصابة، اتبع السلامة الحيوية بروتوكولي الاحتواء اثنين لنقل الفئران من وإلى أداة التصوير ووضع الفأر تخدير في موقف عرضة داخل غرفة التصوير.
في برنامج التصوير، قم بتعيين وقت التعرض، وbinning، وf-stop، ومجال الرؤية حسب ما هو مناسب للتجربة. بعد ذلك، قم بإنشاء منطقة ذات أهمية في موقع الجرح وقياس متوسط التدفق المكتشف في الفوتونات في الثانية. لقياس الخلفية، قم بإنشاء منطقة ذات أهمية على مساحة عشوائية على منصة التصوير واطرح رقم الخلفية للفوتونات في الثانية.
في نهاية التجربة ، في مجلس الوزراء سلامة البيولوجية ، واستخدام مقص معقمة ملقط لإخراج أسرة الجرح ووضع كل سرير في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة في أنبوب البولي بروبلين 1.5 ملليلتر. اِنم نسيج الجرح بمقص و ينقب قطع الأنسجة على شاكر بأربع درجات مئوية في 300 دوران في الدقيقة لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، دوامة كل أنبوب لمدة 10 ثانية قبل تخفيفها بشكل متسلسل النفايات البكتيرية في برنامج تلفزيوني والطلاء النفايات البكتيرية المخففة على أجار LB لتحديد حجم العبء البكتيري.
هذه الصورة التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام نظام التصوير البصري يوضح أن هذا النموذج ينتج عنه إضاءة قابلة للكشف. في هذه التجربة، بلغت العدوى ذروتها في اليوم الثالث تلقيح آخر واستمرت سبعة أيام بعد التطعيم على أساس كل من الإضاءة الحيوية وعدد المستعمرة. ثقافة البكتيريا المعزولة من الجرح تثبت كذلك أن وحدات تشكيل مستعمرة كمي لكل جرح ترتبط مع الإنارة المكتشفة.
على الرغم من أن هناك فقدان الوزن السريع الأولي مباشرة بعد الحقن، والحقن المالحة والتغذية التكميلية يمكن استعادة الفئران إلى الأوزان الأولية. تم تحديد جرعة التلقيح المحسوبة التي 50٪ من الجروح التي ستصبح مصابة بشكل كبير لتكون حوالي 7.7 مرات 10 إلى الوحدة الثانية لتشكيل مستعمرة لكل ملليلتر. جرعات أعلى من واحد مرات 10 إلى مستعمرة الرابع تشكيل وحدات لكل ملليلتر نتيجة في معدل العدوى 100٪.
يمكن تطبيق مختلف العلاجات الموضعية والنظامية بعد إجراءات الجرح والتطعيم للتحقيق في العلاجات المحتملة الجديدة لـ Pseudomonas aeruginosa. وينبغي إجراء جميع العمل مع Pseudomonas aeruginosa والفئران المصابة مع احتياطات السلامة BSL-2 وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة السلامة الحيوية المؤسسية للباحث واستخدام الحيوانات.
