このプロトコルは、異物移植や免疫抑制を必要とせずに慢性の緑膿菌創傷感染のモデルを記述しているため、重要である。完全な厚さの切除創傷の24時間後に緑膿菌による遅れた接種は、細菌の急速なクリアランスと普及を引き起こし、7〜10日間続く感染症を確立する。このユニークなモデルは、細菌病因の調査、宿主病原体相互作用、および慢性シュードモナス緑膿症創傷感染症のための新しい治療法の開発のための有用なツールとなるでしょう。
手順のデモンストレーションで私を支援することは、ダン・リュウ、ボリキー研究所の医学生になります。処置を開始する前に、麻酔を受けた8〜12週齢のマウスの重量を量ってベースラインの重さを得て、マウスを起こしやすい位置に置きます。ペダル反射への応答の欠如を確認した後、皮下に各側面に250マイクロリットルの事前温めた無菌0.9%塩化ナトリウムをマウスに注入する。
電気剃毛を使用して、マウスの後ろ面から毛髪を取り除き、露出した皮膚に脱毛クリームの薄い層を塗布します。20~60秒後、ガーゼをぬるま湯で湿らせた髪と余分なローションを取り除きます。完全な厚さの切除傷の外科のために、最初に25ゲージの針を使用して、マウスの中部の下方領域で1キログラムあたり0.6〜1ミリグラムの持続放出ブプレノルフィンを注入し、3つの代替無菌ベタジンとアルコール綿棒で円形に外科部位を拭く。
外科部位の上にプラスチック製のクリングラップドレープを置き、皮膚のトートを大胆に伸ばします。皮膚が乾燥したら、直径6ミリの無菌皮膚生検パンチを使用して、左後ろ座表皮を通して最初の切開を行い、続いて右下振れ表皮に2回目の切開を行う。鉗子を使用して、左の輪郭を描いた傷領域の中央から皮膚をテントにし、はさみを使用して表皮および真皮層を切除します。
右側の輪郭を描いた傷領域の切開を繰り返して対称的な切除傷を作成した後、両方の創傷を50マイクロリットルの無菌生理食塩水で洗浄する。手術部位および周囲の皮膚が乾燥したら、透明なフィルムドレッシングで傷口とドーサムを覆い、完全な再発まで監視する加熱パッドのきれいなケージにマウスを置きます。手術の24時間後、再麻酔マウスを再び計量し、両方の側面に250マイクロリットルの事前温めた無菌0.9%塩化ナトリウムを皮下注射する。
次に、27ゲージ針を備えた500マイクロリットルの結核安全キャップシリンジに100マイクロリットルの発光P.aeruginosaひずみ懸濁液を負荷し、各創傷に透明なフィルムドレッシングを通して40マイクロリットルの細菌懸濁液を注入する。細菌懸濁液が十分に混合され、透明なドレッシングがそのままであることを確認します。針ベゼル側を上にして透明なドレッシングを1回だけ穿刺してください。
その後、監視と加熱ページ上のケージにマウスを返し、ケージの床に食品ペレットの間に挟まれた高カロリー栄養サプリメントペーストを提供します。LB寒天プレートに残りの接種をプレートし、投与された細菌の数を確認するためにコロニーを数えます。感染した創傷のインビボイメージングの場合、マウスとイメージング機器との間でのマウスの輸送のための生体安全レベル2封じ込めプロトコルに従い、麻酔付きマウスをイメージングチャンバー内の起こりやすい位置に置きます。
イメージングソフトウェアでは、実験に適した露出時間、ビニング、fストップ、視野を設定します。次に、創傷部位に関心領域を作成し、1秒間に検出された光子の平均検出されたフラックスを測定する。背景を測定するには、イメージングプラットフォーム上のランダム領域上に対象領域を作成し、1 秒あたりのフォトンの背景数を減算します。
実験の最後に、バイオセーフティキャビネットで、滅菌はさみと鉗子を使用して創傷床を切除し、各ベッドを1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに1ミリリットルの無菌PBSに入れる。創傷組織をハサミでミンチし、シェーカーの組織片を毎分300回転で2時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、各チューブを10秒間渦液してからPBSで細菌廃液を連続的に希釈し、LB寒天で希釈した細菌廃液をめっきして細菌の負担を定量化する。
この代表的な画像は、撮像光学系を用いて得られた、このモデルが検出可能な発光を生じることを示す。この実験では、感染は3日目の接種後にピークに達し、生物発光とコロニー数の両方に基づいて接種後7日間持続した。創傷から分離された細菌の培養は、創傷当たりの定量コロニー形成ユニットが検出された発光と相関することをさらに示す。
注射直後に最初の急速な体重減少がありますが、生理学注射と補足栄養はマウスを最初の体重に戻すことができます。創傷の50%が実質的に感染する量の算出された接種量は、ミリリットル当たり第2コロニー形成単位に約7.7倍の10倍であると判断した。ミリリットル当たりの第4コロニー形成単位に10倍より高い用量は、100%の感染率をもたらす。
様々な局所および全身治療は、シュードモナス緑膿症の新しい潜在的な治療法を調査するために、創傷および接種手順の後に適用することができる。シュードモナス・エルギノーサと感染したマウスとのすべての作業は、研究者の制度的なバイオ安全および動物使用委員会のガイドラインに従ってBSL-2安全対策を講じるべきである。
