يوفر بروتوكولنا طريقة لنا لدراسة البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية في بيئة غذائية وجسدية مماثلة لكيفية وجودها المحتمل في الجسم الحي. واحدة من أعظم مزايا هذه التقنية هي القدرة على التقاط صور عالية الدقة وبيانات فينوتبيك من البكتيريا في أحجام السكان ذات الصلة بالعدوى. هذا مجموع من حوالي 10 إلى 1000 خلية.
إثبات الإجراء سيكون أليكسا غانون، مساعدة أبحاث الدراسات العليا من مختبري. للبدء، قم بتعقيم الوسط المحتوي على الموسين تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة أربع ساعات. نقل الموسين المعالج بالأشعة فوق البنفسجية إلى أنابيب معقمة 1.7 ملليلتر في ظل ظروف معقمة وتخزين الأنابيب في ناقص 20 درجة مئوية.
بعد إعداد القاعدة المخزنة مؤقتا، أضف محلول مخزون الموسين إلى القاعدة المخزنة مؤقتا التي تحتوي على الحمض النووي كما هو موضح في مخطوطة النص. في المساء قبل التجربة، تلقيح خمسة ملليلتر من مرق LB مع العديد من مستعمرات Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 من مضاد حيوي يحتوي على لوحة أجار LB وثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع التحريض في 250 ثورة في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، قبل ساعتين على الأقل من بدء التجربة، قم بتشغيل مجهر المسح بالليزر confocal وفتح وحدة الحضانة في برنامج التصوير المرتبط بها.
تمييع 500 ميكرولتر من الثقافة في خمسة ملليلترات من مرق LB الطازج واحتضان التعليق البكتيري عند 37 درجة مئوية و 250 ثورة في الدقيقة لمدة 60 إلى 90 دقيقة. عندما دخلت البكتيريا مرحلة السجل ، بيليه الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي وغسل الخلايا ثلاث مرات مع تصفية برنامج تلفزيوني معقم. بعد الغسيل الأخير، أعيد إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
قياس امتصاص تعليق الخلية البكتيرية في 600 نانومتر لتحديد حجم الثقافة المطلوبة لكثافة بصرية من 0.05 في خمسة ملليلتر من البلغم التليف الكيسي الاصطناعية المتوسطة اثنين. تلقيح الحجم المحسوب لتعليق الخلايا البكتيرية في المتوسطة والدوامة بلطف قبل إضافة ملليلتر واحد من الخلايا إلى كل غرفة من طبق الثقافة البصرية ذات ال غرف الأربع، ثم احتضان البكتيريا لمدة أربع ساعات في ظل ظروف ثابتة عند 37 درجة مئوية. لتصوير المجاميع Pseudomonas aeruginosa عن طريق المجهر المسح بالليزر confocal، في نهاية الحضانة، تعيين ثلاثة آبار من لوحة الثقافة كما يكرر العلاج بالمضادات الحيوية وواحدة فضلا عن عدم السيطرة على العلاج ووضع لوحة على مرحلة ساخنة في المجهر.
حدد هدف غمر الزيت 63X وافتح علامة التبويب لتحديد موقع المجاميع البكتيرية في حقل مشرق. حدد منطقة للتصوير داخل كل بئر واستخدم وحدة المواضع لتخزين موضع المنطقة. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 488 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات إلى 509 نانومتر.
في وحدة الاستحواذ، حدد خيار Z-stack للحصول على الصور واستخدام وحدة متوسط الخط لتقليل الإضاءة الخلفية في قناة GFP ضمن الحجم الإجمالي لصور Z-stack. تعيين الخيار سلسلة زمنية لالتقاط 60 شرائح في كل بئر على فترات 15 دقيقة لمدة 18 ساعة واستخدام استراتيجية التركيز محددة لتخزين طائرة محورية لكل موقف التي سيتم إعادة تصويرها في كل نقطة زمنية طوال التجربة. بعد 4-1/2 ساعة من إعداد تجربة التصوير، قم بتصوير كل موضع لتحديد الكتلة الحيوية الكلية داخل كل بئر من الآبار الأربعة قبل إضافة المضاد الحيوي.
بعد ست ساعات، إضافة المضادات الحيوية بلطف في مرتين أقل من الحد الأدنى للتركيز المثبطة إلى منتصف كل بئر مجرد ضربة واجهة السائل الهواء وانقر فوق بدء التجربة لبدء التصوير العلاج بعد المضادات الحيوية. لعزل الخلايا الحية ، في نهاية فترة التصوير 18 ساعة ، تسمية البكتيريا في كل بئر مع الحجم المناسب من يوديد البروبيديوم وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. في نهاية الحضانة، استخدم حاوية معزولة لنقل اللوحة إلى مقياس التدفق الخلوي وتعيين مقياس الخلايا للكشف عن GFP و propidium iodide باستخدام فوهة 70 ميكرون، ثم قم بتشغيل واحد ملليلتر aliquots من كل ثقافة فائقة بأقل معدل تدفق لفرز المجاميع الإيجابية غير القابلة للتطبيق ل GFP وغير القابلة للتطبيق لبروبيديوم يوديد السلبية Pseudomonas aeruginosa.
لقياس الديناميكيات المجمعة، قم بتحميل الصور في برنامج تحليل صور مناسب وإنشاء مخططات تخطيطية للأعداد المنتجة للتحكم غير المعالج والثقافات المعالجة بالمضادات الحيوية في قناة GFP للسماح بتحديد كمي للفلور الخلفية. لضمان ارتباط الفوكسلات GFP المكتشفة بالكتلة الحيوية البكتيرية، حدد voxel إيجابية GFP بأنها أكبر من أو تساوي 1.5 ضعف قيمة تعداد خلفية GFP. إنتاج السطوح ISO لكافة voxels المتبقية والكشف عن المجاميع الفردية، وتمكين خيار تقسيم الكائنات وتحديد المجاميع ككائنات.
استخدم وحدة الفضل لحساب وحدة التخزين XYZ ومجموع voxels GFP لكل كائن على حدة. تصدير هذه البيانات إلى منصة إحصائية خارجية. تصفية البيانات المصدرة حسب الحجم لتعريف الكائنات ذات وحدات التخزين أكبر من أو يساوي خمسة ميكرومتر مكعب.
إزالة أي كائنات أقل من 0.5 ميكرومتر مكعب واستخدام وحدة الفضل لحساب المسافة من كل كائن فيما يتعلق بالكائنات الأخرى داخل كل صورة. بدلا من ذلك، يمكن حساب المسافة باستخدام الصيغة، ثم استخدم مجموع ومتوسط الحسابات لتحديد الكتلة الحيوية الإجمالية في متوسط الحجم الإجمالي. على الرغم من أن المجاميع البكتيرية المتعددة القابلة للحياة لا تزال قائمة بعد أربع ساعات من تطبيق المضادات الحيوية ، إلا أن إجمالي الكتلة الحيوية للمجموعات الإجمالية داخل الثقافات المعالجة بالمضادات الحيوية ينخفض بشكل كبير مقارنة بالثقافات غير المعالجة.
يمكن استخدام المجهر سلسلة زمنية لتحديد الأنماط المكانية بين المجاميع الحساسة يوديد البروبيديوم إيجابية ومتسامحة GFP إيجابية بعد العلاج بالمضادات الحيوية. من خلال حساب كيفية مساهمة المجاميع من مختلف الأحجام في إجمالي عدد السكان ، يمكن تحديد أنماط كيفية استجابة المجاميع للعلاج بالمضادات الحيوية فيما يتعلق بحجمها وشكلها ووضعها. بعد العلاج بالمضادات الحيوية، يمكن فصل المجاميع القابلة للحياة وغير القابلة للتطبيق بنجاح وفقا للتعبير عن الإشارة الفلورية الخاصة بهم.
نأمل أن يلهم هذا البروتوكول الباحثين الآخرين لدراسة الكائن الحي الذي يختارونه في قرار مماثل. هدفنا هو إيجاد خيوط بيولوجية مشتركة في هذه المجتمعات المعقدة بغض النظر عن موقع العدوى.
