JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم طريقة حساسة ومحددة للكشف عن تعارضات النسخ والنسخ المتماثل الناجم عن الجينات المسرطنة (TRCs) باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA). يستفيد هذا النهج من الأجسام المضادة المحددة التي تستهدف PCNA و phospho-CTD RNAPII ، مما يتيح تقييم انتشار TRC بين نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي II وآلية تكرار الحمض النووي.

Abstract

يستخدم كل من تكرار الحمض النووي ونسخ الحمض النووي الريبي الحمض النووي الجيني كقالب لهما ، مما يستلزم الفصل المكاني والزماني لهذه العمليات. تشكل الصراعات بين آلية النسخ والنسخ ، والتي تسمى صراعات النسخ والنسخ المتماثل (TRCs) ، خطرا كبيرا على استقرار الجينوم ، وهو عامل حاسم في تطور السرطان. في حين تم تحديد العديد من العوامل التي تنظم هذه الاصطدامات ، إلا أن تحديد الأسباب الرئيسية لا يزال صعبا بسبب الأدوات المحدودة للتصور المباشر والتفسير الواضح. في هذه الدراسة ، نتصور بشكل مباشر TRCs باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA) ، والاستفادة من الأجسام المضادة الخاصة ب PCNA و CTD الفسفوري لبوليميراز الحمض النووي الريبي II. يسمح هذا النهج بالقياس الدقيق ل TRCs بين عمليات النسخ المتماثل والنسخ بوساطة بوليميراز الحمض النووي الريبي II. يتم تعزيز الطريقة بشكل أكبر من خلال بادئات الحمض النووي المترافقة تساهميا مع هذه الأجسام المضادة ، إلى جانب تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجسات الفلورسنت ، مما يوفر وسيلة حساسة للغاية ومحددة للكشف عن TRCs الذاتية. يتيح المجهر الفلوري تصور هذه التعارضات ، مما يوفر أداة قوية لدراسة آليات عدم استقرار الجينوم المرتبطة بالسرطان. تعالج هذه التقنية الفجوة في التصور المباشر ل TRC ، مما يسمح بتحليل وفهم أكثر شمولا للعمليات الأساسية التي تؤدي إلى عدم استقرار الجينوم في الخلايا.

Introduction

يعمل الجينوم كقالب للعمليات البيولوجية الأساسية ، بما في ذلك النسخ المتماثل والنسخ. في الخلايا السليمة ، عادة ما يتعاون نسخ الحمض النووي الريبي وآلية تكرار الحمض النووي ويتم فصلهما مكانيا وزمانيا1،2،3،4. ومع ذلك ، في ظل الظروف المرضية ، مثل الإفراط في التعبير عن الأورام ، يمكن أن يتعطل هذا التعاون المتناغم.

غالبا ما تؤدي الجينات المسرطنة إلى مستويات نسخ مرتفعة ، مما يزيد من احتمالية حدوث تصادمات بين آلية النسخ والنسخالمتماثل 5. تغير بعض الجينات المسرطنة بنية الكروماتين ، مما يجعلها أكثر سهولة للنسخ ولكنها قد تعيق تقدم شوكة النسخالمتماثل 5. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تنشيط الجين المسرطن إلى إجهاد النسخ المتماثل عن طريق تسريع دورة الخلية6. يرتفع نشاط RNA polymerase II (RNAPII) بشكل كبير خلال انتقال مرحلة G1 / S بسبب فسفرة كيناز المعتمدة على cyclin (CDK) ل Rb ، والتي تطلق عوامل نسخ E2F التي تعزز نسخ البروتينات الأساسية ، بما في ذلك cyclins و CDKs وجينات التدبير المنزلي7. يبلغ التعبير الجيني هيستون ذروته خلال المرحلة S ، بالتزامن مع تكرار الحمضالنووي 8. علاوة على ذلك ، يتطلب نسخ النصوص الكاملة لبعض الجينات الطويلة جدا أكثر من دورة خليةواحدة 9. مع كل دخول في مرحلة S ، قد يؤدي النشاط المتزامن لآلية النسخ والنسخ المتماثل في نفس المناطق الجينومية إلى مواجهات ضارة ، مما يؤدي إلى صراعات. هذه الصراعات هي مصدر جوهري أساسي لعدم استقرار الجينوم ، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا بتكوين الأورام. كيف تنسق آلية النسخ المتماثل مع نسخ RNAPII لمنع الاشتباكات الضارة والحفاظ على الاستقرار الجيني لا يزال سؤالا مهما. لذلك ، أصبح التصور المباشر لصراعات النسخ والنسخ المتماثل المرتبطة ب RNAPII (TRCs) ضروريا لفهم الآليات الجزيئية التي تحل هذه النزاعات وقد تضع في النهاية الأساس لتسخير هذه النزاعات لأغراض علاجية.

يمكن أن تظهر تعارضات النسخ والنسخ المتماثل (TRCs) في اتجاهين: وجها لوجه ، حيث يتقدم النسخ والنسخ المتماثل نحو بعضهما البعض ، والاتجاه المشترك ، حيث يتحركان في نفس الاتجاه. الاصطدامات المباشرة أكثر تدميرا بكثير من الاصطدامات المشتركة10،11،12،13. تم تحديد تكوين هجينة الحمض النووي الريبي (حلقات R) كمحرك رئيسي ل TRCs. وبالتالي ، فقد استنتج قدر كبير من الأبحاث وجود TRCs من خلال تقييم حدوث حلقات R ومناطقها استجابة للنسخ المتماثل و / أو النسخ غير المنظم10،11. ومع ذلك ، فإن ما إذا كان تراكم حلقات R المشتقة من النسخ بمثابة عقبة متناسبة أمام النسخ المتماثل ويرتبط ارتباطا مباشرا ب TRCs لا يزال سؤالا لم يتم حله. قام الباحثون أيضا بالتحقيق في TRCs من خلال تحليل ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل. على سبيل المثال ، يمكن أن يكشف الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد لجينات المراسل عن توقف مؤقت خاص بالموضع12 ، بينما تسمح فحوصات ألياف الحمض النووي للباحثين بفحص التغيرات في سرعة شوكة النسخ المتماثل ، وكثافة الأصل ، وعدم تناسق الشوكة13. أدى تقدم تقنية التسلسل من الجيل التالي إلى تطوير العديد من الأساليب المبتكرة ، مثل تسلسل شظايا أوكازاكي (Ok-seq) 14،15 ، وتسلسل موقع البدء (ini-seq) 16،17 ، وتسلسل الخيوط الناشئة القصيرة (SNS-seq) 18 ، و Repli-seq19 ، وتسلسل استخدام البوليميراز (Pu-seq) 20. قدمت هذه التقنيات ملفات تعريف على مستوى الجينوم لاستخدام أصل النسخ المتماثل ، واتجاه الشوكة ، وإنهاء النسخ المتماثل ، مما يكشف عن العوامل الرئيسية المشاركة في تنسيق النسخ المتماثل والنسخ. TRIPn-seq هي واحدة من الطرق القليلة القادرة على الكشف المباشر عن النسخ والنسخ المتماثل ، مما يوسع بشكل كبير فهمنا للتنظيم الديناميكي لتكرار الحمض النووي ونسخه في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية21. على الرغم من الأفكار القيمة التي توفرها هذه الأساليب القائمة على التسلسل ، إلا أن تكلفتها العالية وطبيعتها الكثيفة للوقت تحد من تطبيقها الأوسع. لذلك ، من الأهمية بمكان إنشاء طريقة كشف أكثر تحديدا وحساسية وملاءمة وسرعة لتصور وقياس TRCs على مستوى الخلية الواحدة.

يعد اختبار ربط القرب في الموقع (PLA) ، المعروف أيضا باسم تقنية Duolink PLA ، طريقة قوية لتقييم القرب المادي للبروتينات المستهدفة في أقسام الأنسجة أو مزارع الخلايا. تولد هذه التقنية إشارة فقط عندما يكون بروتينان أو مجمعات بروتينية على بعد 40 نانومتر من بعضهما البعض. يتطلب جسمين مضادين أساسيين ضد البروتينات المستهدفة ، كل منهما من نوع مختلف (على سبيل المثال ، الفأر / الأرنب ، أو الأرنب / الماعز ، أو الفأر / الماعز). بعد احتضان العينة بهذه الأجسام المضادة الأولية ، يتم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية المعروفة باسم مجسات PLA (واحد PLUS وواحد MINUS). على عكس الأجسام المضادة الثانوية العادية التي ترتبط بالمناطق الثابتة من الأجسام المضادة الأولية ، ترتبط مجسات PLA تساهميا ببادئات محددة للحمض النووي. عندما تكون البروتينات المستهدفة على مقربة (أقل من 40 نانومتر) ، يمكن أن يتهجن قليل النوكليوتيد الموصل مع كل من مجسات PLA ، مما يسهل الربط الأنزيمي لقليل النوكليوتيدات المرتبطة بها في جزيء DNA كامل الطول. يعمل هذا الحمض النووي المشكل حديثا كعلامة بديلة لتفاعل البروتين المكتشف ويعمل كقالب للتضخيم. ثم يتم تصور المنتج المضخم باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات المسمى بالفلورسنت. إذا كانت البروتينات على بعد أكثر من 40 نانومتر ، فلن تتمكن مجسات PLA من تكوين قالب DNA ، مما يؤدي إلى عدم وجود إشارة يمكن اكتشافها. تم تصوير الرسم التخطيطي لجيش التحرير الشعبى الصينى في الشكل 1. يتم تصور القرب و / أو التفاعل عن طريق المجهر الفلوري كنقاط فلورية ، ويمكن تحديد عدد وكثافة هذه النقاط. منذ اختراعه في عام 2002 ، أصبح PLA شائعا لمراقبة تفاعلات البروتين نظرا لحساسيته العالية وخصوصيته. على عكس المقايسات القائمة على التسلسل ، لا يتطلب PLA سوى كميات صغيرة من العينات ، مما يجعله مناسبا لتحليل العينات النادرة.

أظهرت الدراسات أن التعبير عن طفرة KRAS G12D المسرطنة يؤدي إلى تعارضات النسخ والنسخ المتماثل (TRCs) 22،23. على سبيل المثال ، يشير البحث الذي قدمه Meng et al.23 إلى أن التعبير خارج الرحم ل KRAS G12D في الخلايا الظهارية الأقنية للبنكرياس البشري (HPNE) يعزز TRCs و TRC الحلقات R المرتبطة ب TRC. لتمكين اكتشاف الاصطدامات بين RNAPII النسخ وآلات النسخ المتماثل في خطوط الخلايا ، نقدم بروتوكولا تم تطويره خصيصا لهذا الغرض. يتم نقل البلازميد KRAS (G12D) والتحكم في النواقل إلى خلايا BEAS-2B الظهارية للرئة البشرية ، ويتم التحقق من تعبير KRAS (G12D) ، جنبا إلى جنب مع تلف الحمض النووي (γH2AX) ، بواسطة اللطخة الغربية. يتم تأكيد تراكم حلقة R من خلال تحليل اللطخة النقطية S9.6 ، والذي يشير معا إلى تراكم حواجز النسخ المتماثل وعدم استقرار الجينوم في الخلايا التي تعبر عن KRAS (G12D). أخيرا ، يتم تثبيت الخلايا على شرائح لمقايسة PLA. للكشف الموضعي عن الاصطدامات ، يتم تلطيخ الخلايا أولا بالأجسام المضادة الأولية RNAPII و PCNA ، تلويها تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بمجسات PLA. يتشكل جزيء الحمض النووي الدائري من خلال الربط الناجح ، ويعمل كقالب لتضخيم الدائرة المتدحرجة اللاحقة (RCA). ثم يتم تثبيت الشرائح بوسائط تركيب مناسبة وتصورها تحت المجهر الفلوري. يمكن تحليل الصور باستخدام ImageJ.

Protocol

1. إنتاج الفيروسات العدسية ونقلها إلى خط الخلية المستهدفة

  1. إنتاج فيروس العدسات24
    1. خلايا تغليف البذور 293T في 3 × 106 خلايا لكل صفيحة 10 سم في وسط النسر المعدل من Dulbecco عالي الجلوكوز (DMEM ؛ وسط كامل). تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 18-20 ساعة إضافية.
    2. في أنبوبين سعة 1.5 مل ، قم بإعداد خليط من الحمض النووي بإجمالي 24 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 500 ميكرولتر من Opti-MEM (وسط مصل مختزل) يحتوي على 9.2 ميكروغرام من psPAX2 ، 2.8 ميكروغرام من pMD2.G ، جنبا إلى جنب مع 12 ميكروغرام من بلازميد pLVX-KRAS أو ناقل فارغ على التوالي.
      ملاحظة: نظرا لأن السموم الداخلية تقلل بشكل كبير من كفاءة التعدي ، فمن المستحسن إزالة السموم الداخلية من البلازميد أثناء التنقية.
    3. خفف 144 ميكرولتر من بولي إيثيلينيمين (PEI ؛ 1 مجم / مل) في 1 مل من وسط المصل المختزل ، واخلطه ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. أضف 500 ميكرولتر من PEI المخفف بالتنقيط إلى خليط الحمض النووي المخفف أثناء تحريك الأنبوب برفق. احتضان مخاليط PEI / DNA لمدة 15 دقيقة في RT.
    5. أثناء الحضانة ، قم بسحب الوسائط برفق من الألواح المصنفة مسبقا مقاس 10 سم. استبدل ب 10 مل من DMEM الطازج الكامل.
    6. بعد الحضانة ، قم ببسط ماصة الحمض النووي: خليط تعداء PEI ببطء على ألواح مقاس 10 سم ، مع التأكد من عدم فصل الخلايا.
      ملاحظة: PEI هو كاشف تعداء شائع الاستخدام ، ولكن يجب تحسين تركيزه بعناية لتحقيق التوازن بين كفاءة التعداء والسمية الخلوية. على الرغم من ارتفاع تكلفة Lipofectamine 3000 (كاشف التعدين) ، فقد أظهر كفاءة تعداء أعلى وسمية خلوية أقل مقارنة ب PEI في بعض خطوط الخلايا ، مما يؤدي إلى تحسين إنتاج الفيروس. التثقيب الكهربائي هو بديل آخر يستخدم النبضات الكهربائية لإدخال الأحماض النووية في الخلايا. على الرغم من فعاليته ، إلا أنه يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون أكثر كثافة في العمالة.
    7. قم بتنمية الخلايا لمدة 18 ساعة ، ثم استبدل وسائط التعداء بعناية ب 10 مل من وسط DMEM الكامل الذي يحتوي على 25 ميكرومتر من الكلوروكين.
    8. بعد 72 ساعة من التعدي ، اجمع وسط الثقافة الذي يحتوي على جسيم الفيروس. قم بإزالة العبوة 293T الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
    9. اجمع المادة الطافية وقم بتصفيتها من خلال مرشح بولي إيثر سلفون (PES) 0.45 ميكرومتر. استخدم المادة الطافية الفيروسية مباشرة.
      ملاحظة: يجب أن يتم تقطيع المادة الطافية الفيروسية وتجميدها في النيتروجين السائل والاحتفاظ بها عند -80 درجة مئوية لتجنب فقدان العيار.
  2. عدوى الفيروسات العدسية للخلايا المستهدفة
    1. البذور 2 × 106 خلايا مستهدفة BEAS-2B في لوحين بطول 6 سم وتنمو عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها. عند التنبيغ ، تأكد من أن خلايا BEAS-2B ملتقية بنسبة 70٪ تقريبا.
    2. قم بإزالة الوسط القديم بعناية وأضف 0.5 مل مناسبة من KRAS أو جزيئات الفيروسات الناقلة مع 3 مل من وسط RPMI-1640 الكامل الطازج في لوحين ، على التوالي.
    3. قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 18-20 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5 ٪. استبدل الوسط القديم الذي يحتوي على جزيئات الفيروسات العدسية ب 3.5 مل من وسط الاستزراع الكامل الطازج الدافئ مسبقا. بعد 72 ساعة من التنبيغ ، اجمع الخلايا للفحص التالي.
      ملاحظة: إذا تسبب الحضانة الليلية مع الفيروس في تسمم ، فيمكن تقصير وقت الحضانة إلى 4 ساعات. لتحقيق التوازن بين كفاءة النقل والصحة الخلوية ، يجب مراعاة الاستراتيجيات التالية: (1) تحسين تعدد العدوى. (2) استخدام مستحضرات فيروسية عالية الجودة ؛ (3) استخدام تعدد المركبات (مثل البوليبرين) لتحسين الكفاءة ، مما يسمح باستخدام العيارات الفيروسية المنخفضة وتقليل السمية المحتملة ؛ (4) بالنسبة للدراسات طويلة المدى ، ضع في اعتبارك استخدام أنظمة التعبير المحفز للتحكم في التعبير الجيني المعدل مؤقتا ، وتقليل العبء على الخلايا وتقليل السمية المحتملة.

2. التحقق من تلف الحمض النووي المشتق من KRAS (G12D) وتكوين حلقة R

  1. تأكيد التعبير الجيني وتلف الحمض النووي عن طريق اختبار WB
    1. استنشق وسط الثقافة من اللوحات.
    2. اغسل الخلايا برفق باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) لإزالة أي وسط أو حطام متبقي.
    3. أضف حجما صغيرا من 1x PBS للحفاظ على رطوبة الخلايا أثناء عملية الكشط.
    4. استخدم مكشطة خلية ، أمسكها بزاوية ، واكشط الخلايا برفق من السطح في اتجاه ثابت.
      ملاحظة: احرص على عدم الضغط الشديد ، مما قد يؤدي إلى تلف الخلايا.
    5. قم بإمالة اللوحة واستخدم ماصة لتجميع تعليق الخلية في أنبوب وتدوير الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
    6. قم بإعداد المخزن المؤقت 1x RIPA عن طريق تخفيف المخزن المؤقت 2x RIPA (انظر الجدول 1) ، وأضف كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني وكوكتيل مثبط الفوسفاتيز مباشرة قبل الاستخدام.
    7. قم بتحلل حبيبات الخلية باستخدام مخزن RIPA المبرد مسبقا (1x) واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الجليد. قم بإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية وقم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.
    8. أضف 4 × عازلة تحميل عينة من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى المادة الطافية وقم بتغيير طبيعة البروتينات لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. أولا ، افصل 40 ميكروغراما من البروتين من كل عينة في هلام الرحلان الكهربائي للهلام SDS-polyacrylamide (PAGE) بنسبة 12.5٪ ثم قم بنقله إلى أغشية النيتروسليلوز 0.2 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
    9. بعد الانتهاء من النقل ، قم بسد الأغشية باستخدام Blocking Buffer (5٪ حليب خالي الدسم في محلول ملحي يحتوي على 0.1٪ Tween 20 [TBST; الجدول 1]) لمدة 1 ساعة.
    10. اشطف الغشاء لفترة وجيزة باستخدام TBST ، ثم احتضن الغشاء بالأجسام المضادة الأولية ضد علامة FLAG (1: 2500 تخفيف في PBST) و γH2AX (تخفيف 1: 1000 في PBST) (انظر جدول المواد) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    11. قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية ، واغسل الغشاء باستخدام TBST 3 مرات ، كل مرة لمدة 10 دقائق.
    12. اغمر الأغشية في الأجسام المضادة الثانوية المترافقة ببيروكسيداز الفجل المخفف (HRP) (1: 5,000 في محلول TBST الذي يحتوي على 5٪ حليب خالي الدسم) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    13. اغسل الغشاء باستخدام TBST 3 مرات ، كل مرة لمدة 10 دقائق.
    14. تصور مستويات البروتين عبر كواشف التلألؤ الكيميائي المعزز (ECL) (انظر جدول المواد).
  2. الكشف عن حلقة R بواسطة لطخة النقطة25​
    1. استنشق وسط الثقافة من اللوحات.
    2. اغسل الخلايا برفق باستخدام 1x PBS لإزالة أي وسيط أو حطام متبقي.
    3. أضف حجما صغيرا من 1x PBS للحفاظ على رطوبة الخلايا أثناء عملية الكشط.
    4. استخدم مكشطة خلية ، أمسكها بزاوية ، واكشط الخلايا برفق من السطح في اتجاه ثابت.
      ملاحظة: احرص على عدم الضغط الشديد ، مما قد يؤدي إلى تلف الخلايا.
    5. قم بإمالة اللوحة واستخدم ماصة لتجميع تعليق الخلية في أنبوب وتدوير الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
    6. Lyse 2 × 106 خلايا مع 300 ميكرولتر من محلول تحلل الخلايا المثلجة (انظر الجدول 1). احتضن على الثلج لمدة 10 دقائق. قم بالدوران عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. تحتوي الحبيبات على نوى.
    7. استخدم طرفا واسعا للفتحة لإعادة تعليق كل حبيبات ب 300 ميكرولتر من محلول التحلل النووي المبرد مسبقا (انظر الجدول 1).
    8. أضف 3 ميكرولتر من 20 مجم / مل من بروتيناز K (انظر جدول المواد) إلى كل عينة وهضمها لمدة 3-5 ساعات عند 55 درجة مئوية.
    9. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف (انظر الجدول 1) إلى كل أنبوب واخلطه جيدا.
    10. أضف 400 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25: 24: 1 درجة الحموضة 8.0) إلى كل أنبوب. بعد دوامة قوية ، جهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل الحمض النووي عن محتوى الخلية الآخر.
    11. انقل المرحلة المائية العلوية بعناية إلى الأنابيب الجديدة.
    12. قم بترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 1/10 حجم من أسيتات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2) و 2.5 حجم من الإيثانول المبرد مسبقا بنسبة 100٪ إلى العينة. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 4 ساعات أو طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن تؤدي إضافة الجليكوجين (انظر جدول المواد) إلى العينة إلى زيادة استعادة الحمض النووي من ترسيب الإيثانول. يبلغ تركيز الجليكوجين النهائي حوالي 0.05-1 ميكروغرام / ميكرولتر.
    13. حبيبات الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
    14. اشطف الحبيبات ب 1 مل من الإيثانول المثلج 70٪ والطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5-15 دقيقة عند 12,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    15. تخلص من المادة الطافية بعناية لتجنب إزعاج حبيبات الحمض النووي.
    16. جفف حبيبات الحمض النووي في الهواء لمدة 5-10 دقائق.
    17. قم بإذابة حبيبات الحمض النووي عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE الدافئ مسبقا (pH8.0) واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قياس تركيز الحمض النووي لكل عينة.
    18. تحضير تخفيفات الحمض النووي إلى التركيزات المرغوبة في المخزن المؤقت TE (5 نانوغرام / ميكرولتر إلى 200 نانوغرام / ميكرولتر). ضع 20 ميكرولتر من كل عينة بالتساوي على غشاء نايلون موجب الشحنة بواسطة جهاز لطخة نقطية.
      ملاحظة: للكشف عن حلقات R باستخدام مقايسة اللطخة النقطية ، يوصى بتطبيق ما يقرب من 500 نانوغرام من الحمض النووي الجيني لكل نقطة. لقد ثبت أن هذه الكمية توفر حساسية كافية للكشف عن هجينة الحمض النووي الريبي والحمض النووي عند استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة S9.6 ، والذي يرتبط على وجه التحديد بهذه الهياكل.
    19. قم بتثبيت الحمض النووي عن طريق ربط الحمض النووي بغشاء النايلون (انظر جدول المواد) عبر إعداد الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية "الارتباط التلقائي" (1,200 ميكروجول × 100) (انظر جدول المواد).
    20. اغمر الأغشية في Blocking Buffer (انظر الجدول 1) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم شطف الأغشية لفترة وجيزة مع TBST.
    21. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها بجسم مضاد أولي (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية. تخفيف S9.6 هو 1: 1,000 في TBST الذي يحتوي على 5٪ BSA.
    22. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي واغسله 3 مرات باستخدام TBST ، وفي كل مرة لمدة 10 دقائق.
    23. احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي مترافق ب HRP في 5٪ BSA في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    24. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي واغسله 3 مرات باستخدام TBST ، وفي كل مرة لمدة 10 دقائق.
    25. تصور مستويات الحلقة R عبر كواشف ECL (التلألؤ الكيميائي المحسن) انظر جدول المواد).

3. اختبار جيش التحرير الشعبى الصينى

  1. تحضير الخلية
    ملاحظة: يؤدي نقل الخلايا باستخدام الجين الورمي KRAS G12D إلى زيادة في TRCs ، كما يتضح من إشارة PLA الإيجابية. تميز هذه الطريقة بشكل فعال TRCs التي يحركها الجينات المسرطنة عن مستويات الخلفية دون الحاجة إلى اختيار المضادات الحيوية. ومع ذلك ، فإن تنفيذ اختيار المضادات الحيوية بعد التنبيغ يمكن أن يعزز الإشارة الإجمالية عن طريق إثراء سكان الخلايا التي تم نقلها بنجاح ، وبالتالي تحسين حساسية المقايسة وخصوصيتها.
    1. ضع أكواب غطاء قطرها 12 مم في كل بئر من لوح 12 بئرا.
    2. قم بزرع الخلايا المصابة بفيروس العدسي في هذه الآبار بعد 24 ساعة من الإصابة ، وحافظ على الخلايا على غطاء الزجاج في 500 ميكرولتر من وسط RPMI-1640 الكامل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    3. الأمثل) إذا كان التصميم التجريبي يتضمن اختيار المضادات الحيوية لإثراء الخلايا التي تم نقلها بنجاح ، فأضف المضاد الحيوي المناسب إلى وسط المزرعة في هذه المرحلة.
    4. راقب الخلايا للتأكد من وصولها إلى ما يقرب من 60٪ من التقاء 48-72 ساعة بعد الإصابة.
    5. قم بإزالة RPMI-1640 بعناية وقم باستخراج الخلايا مسبقا باستخدام 0.5٪ NP-40 البارد لمدة 4 دقائق على الثلج.
    6. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت (انظر الجدول 1) مباشرة لإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: ينصح بعدم غسل الخلايا قبل خطوة التثبيت لأن ذلك قد يتسبب في انفصالها عن السطح الذي تنمو عليه ، خاصة إذا كان خط الخلية حساسا للانفصال. لذلك ، غالبا ما يفضل إضافة المحلول المثبت مباشرة.
    7. أوقف التفاعل عن طريق إزالة المخزن المؤقت للتثبيت وغسل الخلايا بعناية باستخدام 1x PBS 3 مرات.
    8. استنشق من PBS وأضف 500 ميكرولتر من الميثانول المبرد مسبقا بنسبة 100٪ إلى الخلايا.
    9. تخلل الخلايا عن طريق الحضانة عند -20 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.
    10. كتل الخلايا مع حل كتلة Duolink لمدة 1 ساعة في RT.
  2. تلطيخ الأجسام المضادة
    1. خفف الماوس المضاد ل RNAPII 8WG16 (1: 500) والأرانب المضادة ل PCNA (D3H8P) (1: 500) في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة Duolink. احتضان الخلايا بخليط الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة الرطوبة.
      ملاحظة: قم بإجراء بروتوكول PLA باستخدام واحد فقط من الأجسام المضادة الأولية (إما مضاد ل RNAPII أو مضاد ل PCNA) مع حذف الآخر. يساعد هذا في تحديد أي إشارة خلفية ناتجة عن تفاعلات غير محددة للأجسام المضادة الفردية أو مجسات PLA.
    2. قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية برفق من الشرائح باستخدام ورقة نفايات خالية من النسالة دون لمس الخلايا. ثم اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام 1x PBS.
    3. قم بإعداد مجسات PLA (أو الجسم المضاد الثانوي) وفقا للإجراء التالي (انظر الجدول 2) ، ثم اخلطه واتركه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. أضف مزيج الأجسام المضادة الثانوية إلى الشرائح واحتضنه في غرفة الرطوبة لمدة ساعتين في RT.
  3. الربط والتضخيم
    1. تخلص من مزيج الأجسام المضادة الثانوية واغسل الشرائح مرتين باستخدام 1x Buffer A لكل منهما لمدة 5 دقائق.
    2. تحضير مزيج الربط وفقا للإجراء التالي (انظر الجدول 2).
    3. ضع 15 ميكرولتر من مزيج الربط على كل شريحة غطاء واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غرفة الرطوبة.
    4. اغسل الشرائح مرتين باستخدام 1x Buffer A لكل منهما لمدة دقيقتين.
    5. قم بإعداد مزيج التضخيم وفقا للإجراء التالي (انظر الجدول 2).
    6. ضع 15 ميكرولتر من مزيج التضخيم على كل شريحة واحتضنه لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة. تخلص من مزيج التضخيم واغسله مرتين باستخدام 1x Buffer B لكل منهما لمدة 10 دقائق.
    7. اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام 0.01x buffer B لمدة 1 دقيقة.
    8. قم بالشفط من المخزن المؤقت B وقم بتركيب الشرائح في وسيط تركيب Duolink In Situ باستخدام DAPI.
  4. تحليل الصور وتحديد العتبة:
    1. حدد عدد بؤر جيش التحرير الشعبى الصينى بواسطة ImageJ. يمكن أن يساعد برنامج تحليل الصور الآلي في تحديد إشارات PLA بموضوعية. اختر عتبة 3 أو أكثر من بؤر PLA لكل نواة كعتبة لأن أقل من 1٪ من خلايا التحكم تكتسب 3 بؤر PLA في ظل ظروف غير مضطربة.
      ملاحظة: نظرا لأن العتبة يتم تحديدها تجريبيا من خلال تحليل عينات وعناصر تحكم متعددة لمراعاة التباين، يجب الحفاظ على إعدادات التصوير المتسقة (مثل وقت التعريض الضوئي والكسب) عبر جميع العينات لضمان إمكانية المقارنة.

النتائج

γH2AX يعمل كمؤشر حيوي لتلف الحمض النووي. الإفراط في التعبير عن KRAS (G12D) يضعف الاستقرار الجيني في هذه الخلايا ، كما يتضح من زيادة إشارة γH2AX في تحليل اللطخة الغربية (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، تشير إشارة اللطخة النقطية S9.6 المكثفة في الخلايا التي تعبر عن KRAS (G12D)...

Discussion

يمكن لآلية النسخ RNAPII أن تخلق عائقا أمام تقدم شوكة تكرار الحمض النووي26،27 ، مما يعزز TRCs وتلف الحمض النووي ، خاصة في الخلاياالسرطانية 28،29. يمكن أن يساعدنا فك رموز البروتينات التي تنظم TRCs وفهم الآليات التفصيلي?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال تمويل الشركات الناشئة لجامعة جنوب الصين.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Clarity Western ECL SubstrateBio-Rad1705061
Duolink In Situ Detection Reagents GreenSigmaDUO92014
FLAG antibodyMilliporeF7425
gamma H2AX antibodyCell Signaling25955
Glycogen, molecular biology gradeThermoFisherR0561
Image JNIHhttps://imagej.net/ij/
nitrocellulose membranes Amersham10600004
PCNA antibodyCell Signaling13110
pLVX-Kras G12DN/AN/A
pMD2.G Addgene 12259
Proteinase K, recombinant, PCR gradeThermoFisherEO0491
psPAX2Addgene 12260
RNAPII antibodySCBTsc-56767
S9.6 antibodyActive motif65683
UV crosslinkersFisher ScientificFB-UVXL-1000

References

  1. Wei, X., Samarabandu, J., Devdhar, R. S., Siegel, A. J., Acharya, R., Berezney, R. Segregation of transcription and replication sites into higher order domains. Science. 281 (5382), 1502-1505 (1998).
  2. García-Muse, T., Aguilera, A. Transcription-replication conflicts: how they occur and how they are resolved. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 553-563 (2016).
  3. Hamperl, S., Cimprich, K. A. Conflict resolution in the genome: how transcription and replication make it work. Cell. 167 (6), 1455-1467 (2016).
  4. Merrikh, H., Zhang, Y., Grossman, A. D., Wang, J. D. Replication-transcription conflicts in bacteria. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 449-458 (2012).
  5. Kotsantis, P., Petermann, E., Boulton, S. J. Mechanisms of oncogene-induced replication stress: Jigsaw falling into place. Cancer Discov. 8 (5), 537-555 (2018).
  6. Gnan, S., Liu, Y., Spagnuolo, M., Chen, C. -. L. The impact of transcription-mediated replication stress on genome instability and human disease. Genome Instab Dis. 1, 207-234 (2020).
  7. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 8518-8528 (2013).
  8. Stein, G. S., Stein, J. L., Van Wijnen, A. J., Lian, J. B. Transcriptional control of cell cycle progression: the histone gene is a paradigm for the G1/S phase and proliferation/differentiation transitions. Cell Biol Int. 20 (1), 41-49 (1996).
  9. Helmrich, A., Ballarino, M., Tora, L. Collisions between replication and transcription complexes cause common fragile site instability at the longest human genes. Mol Cell. 44 (6), 6966-6977 (2011).
  10. Lang, K. S., et al. Replication-transcription conflicts generate R-loops that orchestrate bacterial stress survival and pathogenesis. Cell. 170 (4), 787-799 (2017).
  11. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  12. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. EMBO J. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  13. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Mechanisms of transcription-replication collisions in bacteria. Mol Cell Biol. 25 (3), 888-895 (2005).
  14. Chen, Y. H., et al. Transcription shapes DNA replication initiation and termination in human cells. Nat Struct. Mol Biol. 26 (1), 167-177 (2019).
  15. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 110208 (2016).
  16. Guilbaud, G., Murat, P., Wilkes, H. S., Lerner, L. K., Sale, J. E., Krude, T. Determination of human DNA replication origin position and efficiency reveals principles of initiation zone organisation. Nucleic Acids Res. 50 (13), 7436-7450 (2022).
  17. Langley, A. R., Gräf, S., Smith, J. C., Krude, T. Genome-wide identification and characterisation of human DNA replication origins by initiation site sequencing (ini-seq). Nucleic Acids Res. 44 (21), 10230-10247 (2016).
  18. Besnard, E., et al. Unraveling cell type-specific and reprogrammable human replication origin signatures associated with G-quadruplex consensus motifs. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 837-844 (2012).
  19. Zhao, P. A., Sasaki, T., Gilbert, D. M. High-resolution Repli-Seq defines the temporal choreography of initiation, elongation and termination of replication in mammalian cells. Genome Biol. 21 (1), 176 (2020).
  20. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221 (2022).
  21. St Germain, C. P., Zhao, H., Sinha, V., Sanz, L. A., Chédin, F., Barlow, J. H. Genomic patterns of transcription-replication interactions in mouse primary B cells. Nucleic Acids Res. 50 (4), 2051-2073 (2022).
  22. Edwards, D. S., et al. BRD4 prevents R-Loop formation and transcription-replication conflicts by ensuring efficient transcription elongation. Cell Rep. 32 (12), 108166 (2020).
  23. Meng, F., et al. Base-excision repair pathway regulates transcription-replication conflicts in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep. 43 (10), 114820 (2024).
  24. Pirona, A. C., Oktriani, R., Boettcher, M., Hoheisel, J. D. Process for an efficient lentiviral cell transduction. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa005 (2020).
  25. Ramirez, P., Crouch, R. J., Cheung, V. G., Grunseich, C. R-Loop analysis by dot-blot. J Vis Exp. 167, e62069 (2021).
  26. Gómez-González, B., Aguilera, A. Transcription-mediated replication hindrance: a major driver of genome instability. Genes Dev. 33 (15-16), 1008-1026 (2019).
  27. Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V., Macek, B., Popov, N. RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nat Commun. 14 (1), 5147 (2023).
  28. Zardoni, L., et al. Elongating RNA polymerase II and RNA:DNA hybrids hinder fork progression and gene expression at sites of head-on replication-transcription collisions. Nucleic Acids Res. 49 (22), 12769-12784 (2021).
  29. Xiao, Y., et al. Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing. Nat Methods. 21, 247-258 (2024).
  30. Tang, J., et al. Enhancing transcription-replication conflict targets ecDNA-positive cancers. Nature. 635, 210-218 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TRCs II PCNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved