CAR T hücre tedavisi, bazı patolojik kanserlerin tedavisinde benzeri görülmemiş bir başarı elde etmiştir. Bu çalışmada, geçici CAR T hücreleri oluşturmak için viral olmayan, uzun entegre bir yaklaşım tanıttık ve CAR T hücresi fonksiyonunu değerlendirmek için hedefli prosedürler sağladık. Araştırmamız, daha uygun maliyetli bir yaklaşımla güvenli ve etkili CAR T hücreleri üretmeyi amaçlamaktadır.
CAR T hücreleri tipik olarak viral transdüksiyon ile üretilir. Retrovirüsler ve antivirüsler, CAR gen iletimi için en yaygın viral vektörlerdir. Viral vektörlerin üretimi karmaşık ve maliyetlidir ve viral transdüksiyon, T hücresi genomuna rastgele ve kalıcı CAR kodlayan DNA entegrasyonunu indükler ve bu da güvenlik endişelerine neden olabilir.
Protokolümüz, CAR'ı yalnızca geçişli olarak ifade eden CAR T hücreleri üretmek için viral olmayan bir yaklaşım sunar. Bu yöntem, CAR ekspresyonu için mRNA'yı kullanır ve mRNA'yı T hücrelerine iletmek için elektroporasyon kullanır. Bunun T hücresi genomuna gen entegrasyonu yoktur ve üretim prosedürleri daha basit ve daha uygun maliyetlidir.
Başlamak için, CAR plazmid DNA'sını kısıtlama enzimi BGL2 ile doğrusallaştırın ve fenol kloroform izoamil alkol DNA ekstraksiyon prosedürünü gerçekleştirin. Doğrusallaştırılmış DNA'yı saflaştırdıktan sonra, şablonun boyutunu ve bütünlüğünü agaroz jel elektroforezi ile doğrulayın. İn vitro transkripsiyon için, reaksiyon bileşenlerini karıştırın ve reaksiyon karışımını en az iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Transkripsiyondan sonra, reaksiyona iki mikrolitre ribonükleaz III, DNaz I ekleyin. Yavaşça karıştırın ve şablon DNA'yı bozmak için 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Kopyalanan CAR MRNA'yı bir RNA temizleme kiti ile saflaştırın ve nükleaz içermeyen suyla seyreltin.
Eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce bir spektrofotometre kullanarak mRNA konsantrasyonunu ölçün. İn vitro olarak kopyalanmış ve saflaştırılmış araba mRNA örneğini buz üzerinde çözün. Bir mililitre CAR T ortamında altı kriyoprezerve insan periferik kan mononükleer hücresinin gücüne 10 kez bir kez askıya alın.
T hücrelerini aktive etmek için, eşit sayıda önceden yıkanmış insan T aktivatörü CD3 / CD28 boncukları ekleyin. Hücreleri birkaç gün boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede kültürleyin ve genişletin. 12 oyuklu bir plakanın iki oyuğuna oyuk başına bir mililitre CAR T ortamı ekleyin ve dengeleme için 37 santigrat derecede inkübe edin.
Şimdi, beş kez 10'u altı T hücresinin gücüne steril bir tüpe aktarın. CD3/CD28 boncuklarını çıkarmak için, tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve hücre süspansiyonunu dikkatlice yeni bir tüpe pipetleyin. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin. Tüpü tekrar santrifüjleyin ve hücre peletini 200 mikrolitre Neon tamponu T'de yeniden süspanse edin. Neon tamponu T'de seyreltilmiş beş mikrogram CAR MNA ve toplam 125 mikrolitre hacimde 100 mikrolitre hücreyi karıştırın. Kalan 100 mikrolitre hücreye 25 mikrolitre Neon tampon T ekleyin, bu da negatif kontrol görevi görür.
Neon elektroporasyon sistemini 1.800 volt, 10 milisaniye ve tek bir darbeye ayarlayın. T hücreleri CAR mRNA karışımını Neon 100 mikrolitrelik bir uca aspire etmek için Neon pipeti kullanın ve hücreleri elektropore edin. Elektroporasyonlu hücreleri hemen 12 oyuklu plakadaki dengelenmiş kültür ortamına aktarın ve hücreleri kullanıma hazır olana kadar genişletmek için plakayı inkübatöre geri koyun.
Elektroporasyondan altı saat sonra akış sitometrik analizi için CAR mRNA ile transfekte edilen T hücrelerini alın. CAR T hücrelerini bir pipetle birkaç kez karıştırın ve en az bir kez 10 ila beş hücrenin gücüne beş mililitrelik floresanla aktive edilmiş hücre sıralama veya FACS tüpüne aktarın. Tüpe üç mililitre soğuk yıkama tamponu ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini 100 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Askıya alınmış hücrelere iki mikrolitre floresan etiketli tespit antikoru ve yedi AAD canlılık boyası ekleyin. Numuneyi karıştırın ve ışığa maruz kalmaktan kaçınarak 30 dakika buz üzerinde inkübe edin, ardından hücreleri üç mililitre soğuk yıkama tamponu ile yıkayın ve tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de tekrar santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri hemen bir akış sitometresi kullanarak analiz edin. Hücre yüzeyindeki CAR antijenini eksprese eden besiyerini tümör hücrelerinden çıkarın. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, 37 santigrat derecede bir dakika boyunca bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA çözeltisi ile inkübe edin, daha sonra uygun kültür ortamında bir ila beş çarpı 10 ila mililitre başına beş hücre kuvvetinde bir yoğunlukta tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
Daha sonra, E-plakasına 50 mikrolitre önceden ısıtılmış tümör hücresi kültürü ortamı ekleyin ve arka plan empedansını ölçmek için gerçek zamanlı bir hücre analizine veya RTCA cihazına yerleştirin, ardından her bir oyuğa 100 mikrolitre tümör hücresi süspansiyonu ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca oda sıcaklığında dengeleyin. E-plakayı RTCA cihazına geri yerleştirin ve her beş ila 15 dakikada bir yapılan ölçümlerle 24 saat boyunca hücre indeksini izleyin. Ertesi gün, CAR T hücresi süspansiyonunu hazırlayın.
Hücre indeksi kaydını duraklatın ve E-plakayı RTCA cihazından çıkarın. Plakayı hafifçe eğin ve tümör hücrelerini rahatsız etmeden her bir oyuktan 50 mikrolitre kültür ortamını dikkatlice çıkarın, ardından her oyuğa 100 mikrolitre CAR T hücresi veya kontrol T hücresi ekleyin. E-plakayı RTCA cihazına geri koyun ve her beş ila 24 dakikada bir süpürme ile en az 15 saat boyunca hücre indeksi izlemeye devam edin.
Hücre indeksi izlemeyi durdurun ve sitotoksisite sonucunu analiz edin. Sitokin sekresyon analizi için, süpernatanı her bir oyuktan yuvarlak bir tabana veya V şeklinde 96 oyuklu bir plakaya aktarın. 96 oyuklu plakayı 300 G'de oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanları dikkatlice yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın.
Son olarak, ticari ELISA kitlerini kullanarak süpernatanlardaki sitokin seviyelerini ölçün. CAR mRNA dizisi, jel elektroforezi ile yaklaşık iki kilobaz boyutunda olduğu doğrulandı. Aktive edilmiş T hücrelerinin %50'sinden fazlası, elektroporasyondan sonraki birinci günde CAR'ı eksprese etti ve beşinci günde yaklaşık %10'a düşmeden önce ikinci günde %70'in üzerine çıktı.
CAR T hücreleri, tümör empedansında keskin bir azalma ile gösterilen HER2 pozitif SK-OV-3 tümör hücrelerine karşı önemli sitotoksisite gösterirken, kontrol T hücreleri minimal etki gösterdi. CAR T hücre kültürü ortamında yüksek seviyelerde interferon gama sekresyonu tespit edildi, ancak kontrol grubunda tespit edilmedi.
