La terapia de células T con CAR ha logrado un éxito sin precedentes en el tratamiento de ciertos cánceres patológicos. En este estudio, introdujimos un enfoque no viral de integración prolongada para generar células CAR-T transitorias y proporcionamos procedimientos específicos para evaluar la función de las células CAR-T. Nuestra investigación tiene como objetivo generar células CAR-T seguras y eficaces con un enfoque más rentable.
Las células CAR-T generalmente se generan por transducción viral. Los retrovirus y los antivirus son los vectores virales más comunes para la transmisión del gen CAR. La fabricación de vectores virales es compleja y costosa, y la transducción viral induce la integración aleatoria y permanente del ADN que codifica para CAR en el genoma de las células T, lo que puede causar problemas de seguridad.
Nuestro protocolo ofrece un enfoque no viral para generar células CAR-T que solo expresan CAR de forma transitiva. Este método utiliza ARNm para la expresión de CAR y emplea la electroporación para administrar el ARNm a las células T. Esto no tiene integración génica en el genoma de las células T, y los procedimientos de fabricación son más simples y rentables.
Para comenzar, linealice el ADN del plásmido CAR con la enzima de restricción BGL2 y realice el procedimiento de extracción de ADN de fenol-cloroformo isoamílico. Después de purificar el ADN linealizado, verifique el tamaño y la integridad de la plantilla con electroforesis en gel de agarosa. Para la transcripción in vitro, mezcle los componentes de la reacción e incube la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante al menos dos horas.
Después de la transcripción, agregue dos microlitros de ribonucleasa III, DNasa I a la reacción. Mezclar suavemente e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados para degradar el ADN molde. Purifique el ARNm de CAR transcrito con un kit de limpieza de ARN y dilúyalo en agua sin nucleasas.
Mida la concentración de ARNm con un espectrofotómetro antes de almacenarlo a menos 80 grados Celsius. Descongele la muestra de ARNm de coche transcrita y purificada in vitro en hielo. Suspenda una vez 10 a la potencia de seis células mononucleares de sangre periférica humana criopreservadas en un mililitro de medio CAR-T.
Para activar las células T, agregue un número igual de perlas de activador T humano CD3/CD28 prelavadas. Cultive y expanda las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono durante varios días. Agregue un mililitro de medio CAR-T por pocillo a dos pocillos de una placa de 12 pocillos e incube a 37 grados Celsius para mantener el equilibrio.
Ahora, transfiera cinco veces 10 a la potencia de seis células T a un tubo estéril. Para retirar las perlas de CD3/CD28, coloque el tubo en un soporte magnético y pipetee con cuidado la suspensión de la célula en un tubo nuevo. Centrifugar el tubo a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de PBS estéril. Vuelva a centrifugar el tubo y vuelva a suspender el pellet de celda en 200 microlitros de tampón Neon T.Mezcle cinco microgramos de CAR MNA diluidos en el tampón Neon T y 100 microlitros de células en un volumen total de 125 microlitros. Agregue 25 microlitros de tampón Neon T a los 100 microlitros restantes de células, lo que sirve como control negativo.
Configure el sistema de electroporación Neon a 1.800 voltios, 10 milisegundos y un solo pulso. Utilice la pipeta Neon para aspirar la mezcla de ARNm CAR de las células T en una punta de 100 microlitros Neon y electroporar las células. Transfiera inmediatamente las células electroporadas al medio de cultivo equilibrado en la placa de 12 pocillos y devuelva la placa a la incubadora para expandir las células hasta que estén listas para su uso.
Recupere las células T transfectadas con ARNm de CAR para el análisis de citometría de flujo tan pronto como seis horas después de la electroporación. Mezcle las células CAR-T varias veces con una pipeta y transfiera al menos una vez 10 a la potencia de cinco células a un tubo de clasificación de células activado por fluorescencia de cinco mililitros, o FACS. Agregue tres mililitros de tampón de lavado en frío al tubo y centrifugue el tubo a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en 100 microlitros de tampón de lavado. Agregue dos microlitros de anticuerpo de detección marcado con fluorescencia y siete tintes de viabilidad AAD a las células suspendidas. Mezclar la muestra e incubarla en hielo durante 30 minutos, evitando la exposición a la luz, luego lavar las células con tres mililitros de tampón de lavado en frío y centrifugar el tubo nuevamente a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de tampón de lavado e inmediatamente analice las células con un citómetro de flujo. Eliminar el medio de las células tumorales que expresan el antígeno CAR en la superficie celular. Después de lavar las células con PBS, incubarlas con un mililitro de solución de EDTA al 0,05% de tripsina durante un minuto a 37 grados centígrados, luego preparar una suspensión de una sola célula en el medio de cultivo apropiado a una densidad de uno a cinco veces 10 a la potencia de cinco células por mililitro.
A continuación, agregue 50 microlitros de medio de cultivo de células tumorales precalentado a la placa E y colóquela en un análisis celular en tiempo real, o instrumento RTCA, para medir la impedancia de fondo, luego agregue 100 microlitros de la suspensión de células tumorales a cada pocillo y equilibre la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Vuelva a colocar la placa E en el instrumento RTCA y controle el índice de células durante 24 horas, con mediciones tomadas cada cinco a 15 minutos. Al día siguiente, prepare la suspensión de células T con CAR.
Detenga el registro del índice de celdas y retire la placa E del instrumento RTCA. Incline ligeramente la placa y retire con cuidado 50 microlitros de medio de cultivo de cada pocillo sin alterar las células tumorales, luego agregue 100 microlitros de células T con CAR o células T de control a cada pocillo. Regrese la placa E al instrumento RTCA y reanude el monitoreo del índice celular durante al menos 24 horas, con barridos tomados cada cinco a 15 minutos.
Detenga el monitoreo del índice celular y analice el resultado de citotoxicidad. Para el análisis de secreción de citocinas, transfiera el sobrenadante de cada pocillo a un fondo redondo o a una placa de 96 pocillos en forma de V. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a una nueva placa de 96 pocillos.
Por último, mida los niveles de citocinas en los sobrenadantes utilizando kits comerciales de ELISA. Se validó que la secuencia de ARNm de CAR tenía un tamaño aproximado de dos kilobases mediante electroforesis en gel. Más del 50% de las células T activadas expresaron el CAR el primer día después de la electroporación, aumentando a más del 70% en el segundo día antes de disminuir a aproximadamente el 10% en el quinto día.
Los linfocitos CAR-T mostraron una citotoxicidad significativa contra las células tumorales SK-OV-3 positivas para HER2, indicada por una reducción drástica de la impedancia tumoral, mientras que los linfocitos T de control mostraron un efecto mínimo. Se detectaron altos niveles de secreción de interferón gamma en el medio de cultivo de células CAR-T, pero no en el grupo control.
