Bu nedenle araştırmamızın ana odak noktası, doku rejenerasyonu için hücre dışı vezikül olan mezenkimal stromal hücreleri incelemektir. Araştırmamız için bir konu ve hedef, hücresiz yaklaşımı hücre tedavilerinin yanı sıra klinik uygulamaya dönüştürmektir. Karakterizasyon çok önemlidir ve günümüzde derin bir karakterizasyon için saf veziküle sahip olmak çok zordur çünkü yüksek saflık elde etmek için protokoller yoktur.
Bu nedenle, hücre dışı veziküle dayalı bu yeni yaklaşımı incelemek, karakterize etmek ve nihayetinde klinik uygulamaya dönüştürmek için hücre sıralayıcı teknolojisini uygulamak istedik, Protokolümüz numune hazırlama, hücre dışı vezikül karakterizasyonu, sıralama ve sıralama sonrası analiz olmak üzere dört bölümden oluşmaktadır. Sıralama kısmına odaklanacağız. Göreceğiniz gibi, bazı komutlar sıralayıcı yazılımında gerçekleştirilirken diğerleri dokunmatik ekranda gerçekleştirilecektir.
Protokolümüz, diğer EV ayırma yöntemlerine kıyasla önemli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, 35 psi'de 70 mikro nozulun kullanılması, EV sıralama sonrası bütünlüğün korunmasını sağlar. Daha sonra belirli bir EV popülasyonunu izole etmek mümkündür ve son olarak cihaz, işlemi tekrarlanabilir hale getirmek için sıralama ayarını kaydetmeye izin verir.
Laboratuvarımızda, hücre dışı vezikül analizi için yeni çok renkli panel geliştirmek için çalışıyoruz. Özellikle, cihaz kurulumuna ve florokromların incelenmesine odaklanıyoruz. Nadir vezikül popülasyonunu tanımlayabilmenin ve ayırabilmenin, karakterizasyonlarında ve ayrıca biyolojik süreçlerdeki rollerinin incelenmesinde iyi bir gelişme sağlayabileceğine inanıyoruz.
Başlamak için, hücre sıralayıcının basınç hattını ve vakum sistemini açın. Cihazı açın, biyogüvenlik kabinini açın ve ayırıcı yazılımını başlatın. Akışkan sisteme basınç uygulayın ve ardından akışkan sistemini açın.
Damlacıklar oluşturmak için titreşen nozuldaki piezoelektrik kristali bırakın, sürün. Sistemdeki kabarcıkları ortadan kaldırmak için kabarcık giderme prosedürünü gerçekleştirin. Daha sonra, yüksek diferansiyel basınçta beş dakika boyunca beş mililitrelik bir temizleme solüsyonu tüpü çalıştırın, ardından beş dakika boyunca beş mililitrelik bir deiyonize su tüpü çalıştırın.
Manuel başlatma prosedürünü gerçekleştirmek için lazer kontrol sekmesine gidin ve lazer gücünü açın. Akışın dikey hizalamasını inceleyin. Lazer noktası belirleme için, lazer akışı kesme tırnağına basın.
Yeşil ok düğmesine tıklayın ve dokunmatik ekrandaki yönergeleri izleyin. IntelliSort'u başlatın ve akışın bir damlacık oluşturmasına neden olan varsayılan genlik değeriyle birlikte bırakma sürücüsü frekansını ayarlayın. İnce lazer hizalama prosedürü için, örnekleyiciye beş mililitrelik bir QC hizalama boncukları tüpü yükleyin ve QC protokolünde çalıştırın.
İnce hizalama sekmesinde, iyi sıkıştırılmış ve harmanlanmış boncukları görselleştirmek için X ve Y eksenlerinde istenen parametreleri seçin. Manuel hizalama kontrol edildikten sonra, QC boncuklarının çapı üç mikrometreye ayarlanmış olarak otomatik QC'yi gerçekleştirin. QC alımını yazılım hizalama protokolüne kaydedin.
IntelliSort'u sonlandırmak için, saptırma plakalarını sıralayıcıda doğru konuma getirin ve voltajı yaklaşık 3.000 volta getirin. Altı tüplü tutucu sıralama çıkışını seçin. Etkinleştirmek ve test akışını gerçekleştirmek için akış göstergesinde akışları seçin.
Doğru bırakma gecikmesini ayarlamak ve akışları yeniden doğrulamak için IntelliSort otomatik bırakma gecikmesi belirleme düğmesini etkinleştirin. Ardından IntelliSort bakım modunu etkinleştirin ve bırakma gecikmesini manuel olarak doğrulayın. Manuel, düşme geciktirme protokolünü sıralayıcı yazılımına yükleyin ve floresan kontrol boncukları edinin.
Doğru kaydırma tutucuyu taktıktan sonra, sıralamayı seçin, ardından bırakma gecikmesi sihirbazı ve sıralama mantığını izleyin. Floresan boncukların %97'sinin beşinci su birikintisinde bulunduğunu bir floresan mikroskobu ile doğrulayın. Başlamak için hücre sıralayıcıyı ayarlayın ve IntelliSort'u etkinleştirin.
Saçılma kalibrasyonunu gerçekleştirdikten sonra, her numune için numune alma adımlarını gerçekleştirin. Örnek sıralama için yeni bir protokol oluşturmak için, araç çubuğunda dosya'yı ve ardından protokol'ü ve yeni'yi seçin. Sıralayıcı yazılımındaki veri toplama ayarına tıklayın.
Alım parametresi penceresinde, ilgilendiğiniz kanalları seçin ve diğerlerini devre dışı bırakın. Ardından, numunenin beş mililitrelik bir tüpünü örnekleyiciye yerleştirin. Dokunmatik ekranda, yükle düğmesine tıklayın.
Sıralayıcı yazılımı araç çubuğunda, alım'ı seçin ve başlat'a basın. Örnek özellikleri penceresi görüntülendiğinde, örnek adını girin ve Tamam'a tıklayın. Geçit stratejisini oluşturmak için histogramı seçin ve ardından histogram oluşturun.
İlki X ekseninde 488-FSC1-Yükseklik kütüğü ve Y ekseninde 488-SSC-Yükseklik kütüğü olmak üzere üç nokta grafiği oluşturun. İkincisi X ekseninde 488-FSC-2 Yükseklik kütüğü ve Y ekseninde 488-SSC-Yükseklik kütüğü ve üçüncüsü X ekseninde 488 513 X 26 CFSE Yükseklik kütüğü ve Y ekseninde 488-SSC Yükseklik kütüğü ile. Alım'a ve ardından başlat'a tıklayın ve örneğin adını girin.
Satın alma sırasında, CFSE negatif olaylarını tanımlayan bir bölge ve CFSE pozitif olaylarını tanımlayan bir bölge çizin. Ardından sıralama sekmesinde, sıralanacak bölgeyi belirleyin. Akış hızı sabit olduğunda, alımı ve ardından durdurmayı seçin.
Sıralayıcı yazılımının araç çubuğunda sırala'yı seçerek sıralamaya başlayın. Sıralama ayarlarını kaydetmek için, araç çubuğunda sıralamayı seçin ve ardından sıralama ayarlarını kaydet'i tıklatın. Sıralanan popülasyonun saflığını kontrol etmek için, önce yüksek diferansiyel basınçta 10 dakika boyunca beş mililitrelik bir temizleme solüsyonu tüpü alın, ardından 10 dakika boyunca beş mililitrelik bir deiyonize su tüpü alın.
0.22 mikrometre, filtrelenmiş PBS edinin ve CFSE pozitif olay olmadığını kontrol edin. Daha sonra, sıralanan numunenin beş mikrolitresini 100 mikrolitre 0.22 mikrometre, filtrelenmiş PBS ile seyreltin. Sıralanan örnekleri alın ve hacimleri kaydedin Adipoz kaynaklı hücre dışı veziküllerde CD9, CD63, CD81 ve CD44'ün ekspresyonu CFSE sıralamasından sonra değişmedi.
Nanopartikül izleme analizi, veziküllerin boyut dağılımının sıralama öncesi ve sonrası tutarlı kaldığını gösterdi. Transmisyon elektron mikroskobu analizi, veziküllerin morfolojisinin sıralama işlemi tarafından önemli ölçüde değiştirilmediğini gösterdi. Ek olarak, tedavi% 0.1 idi. Triton X-100, veziküler kökenlerini doğrulayan CFSE pozitif veziküllerin sayısını azalttı.
