따라서 우리 연구의 주요 초점은 조직 재생을 위한 세포외 소포체인 중간엽 기질 세포를 연구하는 것입니다. 우리 연구의 과제이자 목표는 cell-free 접근법을 세포 치료와 함께 임상 적용으로 전환하는 것입니다. 특성화는 매우 중요하며, 오늘날에는 높은 순도를 달성하기 위한 프로토콜이 없기 때문에 깊은 특성화를 위해 순수한 소포를 갖는 것은 매우 어렵습니다.
따라서 우리는 세포 분류기 기술을 구현하여 세포 외 소포체를 기반으로 하는 이 새로운 접근 방식을 연구, 특성화 및 궁극적으로 임상 실습에 적용하기를 원했으며, 당사의 프로토콜은 시료 준비, 세포 외 소포체 특성화, 분류 및 분류 후 분석의 네 부분으로 구성됩니다. 우리는 정렬 부분에 초점을 맞출 것입니다. 보시다시피 일부 명령은 분류기 소프트웨어에서 수행되고 다른 명령은 터치 스크린에서 수행됩니다.
우리의 프로토콜은 다른 EV 분리 방법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 첫째, 35psi에서 70 마이크로 노즐을 사용하면 EV 포스트 분류의 무결성을 보존할 수 있습니다. 그런 다음 특정 EV 모집단을 분리할 수 있으며 마지막으로 기기는 프로세스를 재현할 수 있도록 정렬 설정을 저장할 수 있습니다.
우리 연구실에서는 세포외 소포체 분석을 위한 새로운 다색 패널을 개발하기 위해 노력하고 있습니다. 특히, 우리는 기기 설정과 형광 색소 연구에 중점을 두고 있습니다. 우리는 희귀한 소포 개체군을 식별하고 분리할 수 있는 것이 소포의 특성화를 개선하고 생물학적 과정에서 소포의 역할을 연구하는 데 도움이 될 수 있다고 믿습니다.
시작하려면 셀 분류기의 압력 라인과 진공 시스템을 엽니다. 기기를 켜고 생물 안전 캐비닛을 연 다음 분류기 소프트웨어를 실행합니다. 유체 시스템에 압력을 가한 다음 유체 시스템을 켭니다.
드롭 드라이브를 활성화하여 노즐의 압전 결정을 진동시켜 물방울을 생성합니다. 거품 제거 절차를 수행하여 시스템의 기포를 제거합니다. 그런 다음 5ml 튜브의 세척액을 높은 차압에서 5분 동안 작동한 다음 5ml 튜브의 탈이온수 튜브를 5분 동안 실행합니다.
수동 시작 절차를 수행하려면 레이저 제어 탭으로 이동하여 레이저 전원을 켜십시오. 하천의 수직 정렬을 검사합니다. 레이저 스폿 측정을 위해 레이저 스트림 인터셉트 탭을 누릅니다.
녹색 화살표 버튼을 클릭하고 터치스크린 모니터의 지시를 따릅니다. IntelliSort를 초기화하고, 스트림이 드롭릿을 형성하도록 하는 기본 진폭 값과 함께 드롭 구동 주파수를 설정합니다. 미세 레이저 정렬 절차의 경우 QC 정렬 비드의 5ml 튜브를 샘플러에 로드하고 QC 프로토콜에서 실행합니다.
미세 정렬(Fine Alignment) 탭에서 X 및 Y축에서 원하는 매개변수를 선택하여 잘 압축되고 콜럼된 비드를 시각화합니다. 수동 정렬이 확인되면 QC 비드의 직경을 3마이크로미터로 설정하여 자동 QC를 수행합니다. 소프트웨어 얼라인먼트 프로토콜에 QC 획득을 저장합니다.
IntelliSort를 마무리하려면 분류기의 올바른 위치에 편향판을 배치하고 전압을 약 3, 000볼트로 켭니다. 6-튜브 홀더 정렬 출력을 선택합니다. 스트림 표시기에서 스트림을 선택하여 활성화하고 테스트 스트림을 수행합니다.
IntelliSort 자동 삭제 지연 결정 버튼을 활성화하여 올바른 삭제 지연을 설정하고 스트림을 다시 확인합니다. 그런 다음 IntelliSort 유지 관리 모드를 활성화하고 드롭 지연을 수동으로 확인합니다. 분류기 소프트웨어에 수동 drop-delay 프로토콜을 로드하고 형광 제어 비드를 획득합니다.
올바른 슬라이드 홀더를 삽입한 후 정렬을 선택한 다음 드롭 지연 마법사와 정렬 논리를 선택합니다. 형광 현미경으로 다섯 번째 웅덩이에 형광 구슬의 97%가 있는지 확인합니다. 시작하려면 셀 정렬기를 설정하고 IntelliSort를 활성화합니다.
산란 보정을 수행한 후 각 샘플에 대해 샘플 수집 단계를 수행합니다. 샘플 정렬을 위한 새 프로토콜을 만들려면 도구 모음에서 file(파일)을 선택한 다음 protocol(프로토콜) 및 new(새로 만들기)를 선택합니다. 분류기 소프트웨어에서 데이터 수집 설정을 클릭합니다.
Acquisition Parameter 창에서 관심 채널을 선택하고 나머지는 비활성화합니다. 그런 다음 샘플의 5ml 튜브를 샘플러에 넣습니다. 터치 스크린에서 로드(load) 버튼을 클릭합니다.
분류기 소프트웨어 도구 모음에서 acquisition을 선택하고 start를 누릅니다. Sample Properties 창이 나타나면 샘플 이름을 삽입하고 Okay를 클릭합니다. 게이팅 전략을 만들려면 히스토그램을 선택한 다음 히스토그램을 만듭니다.
세 개의 점 도표를 생성하는데, 첫 번째 도트는 X축에 488-FSC1-Height 로그가 있고 Y축에 488-SSC-Height 로그가 있습니다. 두 번째는 X축에 488-FSC-2 높이 로그, Y축에 488-SSC-Height 로그, 세 번째는 X축에 488 513 X 26 CFSE 높이 로그, Y축에 488-SSC 높이 로그가 있습니다. acquisition을 클릭한 다음 start를 클릭하고 샘플 이름을 삽입합니다.
획득하는 동안 CFSE 음성 이벤트를 식별하는 영역을 그리고 CFSE 긍정적 이벤트를 식별하는 영역을 그립니다. 그런 다음 정렬 탭에서 정렬할 지역을 식별합니다. 유속이 안정되면 Acquisition(획득)을 선택한 다음 Stop(중지)을 선택합니다.
분류기 소프트웨어의 도구 모음에서 정렬을 선택하여 정렬을 시작합니다. 정렬 설정을 저장하려면 도구 모음에서 정렬을 선택한 다음 정렬 설정 저장을 클릭합니다. 분류된 모집단의 순도를 확인하려면 먼저 5ml 튜브의 세척 용액을 높은 차압에서 10분 동안 사용한 다음 5ml 튜브의 탈이온수 튜브를 10분 동안 구합니다.
0.22마이크로미터의 필터링된 PBS를 획득하고 CFSE 양성 이벤트가 없는지 확인합니다. 그런 다음 분류된 시료 5마이크로리터를 0.22마이크로미터의 여과된 PBS 100마이크로리터에 희석합니다. 분류된 샘플을 획득하고 지방 유래 세포외 소포체에서 CD9, CD63, CD81 및 CD44의 발현이 CFSE 분류 후 변하지 않았다는 부피를 기록합니다.
나노 입자 추적 분석은 소포의 크기 분포가 분류 전후에 일관되게 유지되는 것을 보여주었습니다. 투과 전자 현미경 분석은 소포의 형태가 분류 과정에 의해 크게 변경되지 않았음을 나타냅니다. 또한, 트리톤 X-100 치료는 0.1%로 수포 기원을 확인하는 CFSE 양성 소포의 수를 줄였습니다.
