Transgenik zebra balığı, embriyo gelişimini anlamamız için kritik öneme sahip olduğunu kanıtlamıştır. Tol2 sistemi, araştırmacıların FASD çalışmaları için hızlı ve sistematik olarak birden fazla transgenik zebra balığı üretmelerini sağlayan çok yönlü bir araçtır. Modüler tasarım ve yeni kit bileşenleri üretme kolaylığı, Tol2 sistemini, kitin herhangi bir bileşenini yeniden tasarlamak zorunda kalmadan yeni transgenikler üretmek için çok yönlü bir araç haline getirir.
Bu tekniği ilk kez uygulayan araştırmacılara tavsiyem, transgenik yapıların üretilmesi ve enjekte edilmesinin hassasiyeti konusunda eğitim almak için birkaç deneme çalışması yapmalarıdır. Başlamak için, transpozaz içeren Tol2 kiti plazmidini, 10 mikrolitre transpozaz plazmidi, 1.5 mikrolitre kısıtlama endonükleaz reaksiyon tamponu ve 0.3 mikrolitre sıfır bir endonükleazı 500 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek bir sıfır kısıtlama endonükleazı ile doğrusallaştırın. 20 mikrolitreye kadar reaksiyonu RNAse içermeyen suyla doldurun.
Gece boyunca 37 santigrat derecede karıştırın ve sindirin. Ertesi gün, reaksiyon karışımına bir mikrolitre 0.5 molar EDTA, iki mikrolitre beş molar amonyum asetat ve 80 mikrolitre% 100 etanol ekleyerek sindirimi durdurun. Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede karıştırın ve soğutun.
Ertesi gün, DNA peletini RNAse içermeyen suda yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve aspire edin. Daha sonra, numunenin iki mikrolitresini çalıştırarak bir florometre üzerinde mikrolitre başına nanogram cinsinden doğrusal plazmid konsantrasyonunu belirleyin. SP6 mRNA üretimini, 10 mikrolitre 2X NTP / CAP, iki mikrolitre 10X reaksiyon tamponu, 0.1 ila bir mikrogram doğrusal DNA şablonunu iki mikrolitre SP6 enzim karışımında 500 mikrolitrelik bir tüpte birleştirerek ayarlayın.
20 mikrolitreye kadar reaksiyonu RNAse içermeyen suyla doldurun ve 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce karıştırın. İki saat sonra, bir mikrolitre DNAse ekleyin, iyice karıştırın ve 15 dakika daha inkübe edin. 30 mikrolitre lityum klorür çökeltme çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun.
Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede karıştırın ve soğutun. Ertesi gün, mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi santrifüj edin ve peleti bir mililitre% 80 etanol ile yıkamadan önce süpernatantı aspire edin. Peletin havayla kurutulması ve 20 mikrolitre RNAse içermeyen suda tekrar askıya alınması.
Bir florometre kullanarak mRNA konsantrasyonunu belirleyin, ardından tek kullanım için tüp başına 100 nanogram mRNA'yı aliquot edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Reaksiyonu gerçekleştirmek için, P5E, PME ve P3E'nin her biri 10 femtomol ve hedef vektör PDEST'in 20 femtomolünü toplayın. Plazmid kaynağından dört vektörün ve baz çiftinin boyutunu tanımlayın.
Dört vektörün konsantrasyonunu belirledikten sonra, DNA'nın ağırlığını mol başına 660 gram ve plazmid boyutu ve baz çiftleri olarak kullanarak, giriş vektörleri için 10 femtomol'e veya hedef vektör için 20 femtomol'e ulaşmak için gereken toplam plazmid nanogramlarını hesaplayın. Ardından, makalede açıklanan bileşenleri kullanarak sox17:EGFP-CAAX yapısını oluşturun. Plazmid konsantrasyonunu kullanarak, 10 femtomol veya 20 femtoole ulaşmak için gereken her plazmidin toplam mikrolitresini hesaplayın ve ardından beş mikrolitre yarım LR reaksiyonunda kullanılmak üzere bunu ikiye bölün.
10 femtomol P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) ve 20 femtomol hedef vektör üretin. P5E, PME, P3E ve PDEST hacimlerini 500 mikrolitrelik bir tüpte birleştirerek beş mikrolitre yarım LR reaksiyonu ayarlayın. Daha sonra hacmi dört mikrolitre yapmak için steril su ekleyin.
LR enzimini vorteks, reaksiyona bir mikrolitre eklemeden önce her biri bir dakika boyunca iki kez karıştırın ve 25 santigrat derecede inkübe etmeden önce iyice karıştırın. Ertesi gün, 0.5 mikrolitre proteinaz K.Incubate'de 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe ederek LR reaksiyonunu durdurun ve ardından oda sıcaklığına soğutun. Daha sonra, plazmidin üç ila dört mikrolitresini, plazmidi ekleyerek ve hücrelerin 25 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin vererek çözülmüş kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün.
Daha sonra ısı, hücreleri 42 santigrat derecelik bir su banyosunda 30 saniye boyunca şoklar. Isı şokundan sonra, hücrelere 250 mikrolitre antibiyotiksiz zengin sıvı ortam ekleyin ve 1,5 saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Bir ampisilin Luria-Bertani plakasına 300 mikrolitre bakteri süspansiyonu yayın ve gece boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, kolonileri iki fenotipin varlığı açısından tarayın: açık ve opak. Berrak kolonileri birer birer seçin, sıvı kültürü aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede sallayın. 150 nanogram plazmid, 100 nanogram transpozaz mRNA ve% 2 fenol kırmızısını buz üzerinde birleştirin.
Daha sonra hacmi üç mikrolitre yapmak için RNA'sız su ekleyin. Transfer pipetleri kullanarak bir hücre aşaması embriyosunu, agar'ı tamamen kaplayan EM ile doldurulmuş enjeksiyon plakasına aktarın ve ardından enjeksiyon plakasının yuvası başına yaklaşık 50 ila 75 embriyoyu hafifçe bastırın. mRNA plazmid fenol kırmızı karışımını kılcal enjeksiyon iğnesinin açık ucuna ekleyin.
Kılcal iğneyi enjeksiyon teçhizatı armatürüne yerleştirin ve enjeksiyon makinesini açın. İğneyi enjeksiyon plakasına indirin ve enjeksiyon teçhizatı tarafından sadece az miktarda karışımın pompalanmasına izin vermek için forseps kullanarak ucu kırın. Embriyolara, mRNA plazmid fenol kırmızı karışımının üç nanolitrelik bir bolusu ile embriyonun hücre gövdesine enjekte edin.
İşiniz bittiğinde, embriyoları yavaşça yuvadan dışarı atarak enjeksiyon plakasından çıkarın ve pipetleyerek taze EM ile 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Floresan transgen ekspresyonu için uygun gelişim aşamasını seçin ve floresan diseksiyon mikroskobu altında tarayın. Cmlc2 geni için kardiyak spesifik promotör tarafından tahrik edilen GFP gibi floresan transgenik belirteçleri tarayarak floresan olmayan transgenleri tarayın.
Transgenik yerleştirme için pozitif embriyolar yetişkinlere geliştiğinde ve üreme yaşına ulaştığında, onları vahşi tip zebra balıklarına yetiştirerek germline iletimi ve transgen ekspresyonu için ayrı ayrı tarayın. LR rekombinasyonunun dönüşümünden elde edilen örnek bakteri kolonileri gösterilmiştir. Berrak koloniler zamanın %85'inden fazlasında doğru bir LR rekombinasyon ürünü içerirken, opak koloniler hiçbir zaman doğru bir rekombinasyon ürünü içermemiştir.
LR rekombinasyon ürünlerinin dönüşümünden üç koloninin tanısal sindirimi, tek opak koloninin herhangi bir plazmid içermediğini, iki berrak koloninin ise 9.544 baz çiftinde tek bir bant içerdiğini gösterdi. Transpozaz mRNA 1.950 baz çiftinde burada gösterilmiştir. Enjekte edilen embriyoların %75'inde mozaik endoderm EGFP-CAAX ekspresyonu gözlendi.
Gelişmekte olan kalpte Cmlc2 EGFP'nin transgenik belirteç ekspresyonu döllenmeden 24 saat sonra gözlendi. Yetişkin zebra balığı, endoderm EGFP-CAAX ile tamamen etiketlenmiş sox17: EGFP-CAAX tarafından üretilen floresan embriyoların germline iletimine sahipti. Kontrol ve etanol ile tedavi edilen vahşi tip BMP mutant embriyolarında endodermin hem anterior-posterior uzunluğu hem de her bir poşetin bir ila beş poşetten dorsal-ventral uzunluğu ölçüldü.
Endodermin toplam uzunluğu genotip veya tedaviden etkilenmedi. Bununla birlikte, bir ve üçüncü torbalar, tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip embriyolar arasındaki kese uzunluğunda önemli artışlar gösterdi, ancak tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş BMP mutantları arasındaki uzunlukta önemli azalmalar gösterdi. Poşet iki, sırasıyla işlenmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip ve BMP mutant grupları arasında kese boyutunda önemli artışlar gösterdi.
Bu prosedürü denerken, Tol2 sisteminin pipetlenmesi ve seyreltilmesinde ve embriyo enjeksiyonu sırasında hücre gövdesine vurulmasında hassas olmak çok önemlidir.
