We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

Not: tüm zebra balığı çalışmalar ve hayvan bakımı Mayo Kliniği Enstitüsü, IACUC onaylı protokol # A41213 ile uygun olarak yapılmıştır. Transgenesis 1. DNA konstruktları <ol><li> Bir DNA şablonu olarak (BACPAC kaynakları merkezine (BPRC) &#39;den) CH211-270H11 BAC klonu kullanılarak bir 5.2 kb dopamin beta hidroksilaz (d βh) promotör bölgesini 8 yükseltin. 2 dakika için 94 ° C, (94 ° C, 15 saniye, 50 ° C, 10 döngü 30 saniye 68 °: Uzun DNA şablonları ve uzun doğru PCR amplifikasyonu için bir PCR sistemi uygun ve PCR için aşağıdaki döngü programları kullanarak (94 ° C, 15 saniye, 53 ° C, 30 saniye, 68 ° C&#39;de, 8 dakika), 68 ° C, 4 dakika (ileri doğru primer 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39;, 30 devir ile takip olunan Cı, 8 dakika), ve ters primer 5&#39;-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;). </li><li> D βh -pDONRP4-P1R giriş clo oluşturne 8 gibi çoklu ağ geçidi gibi ticari rekombinant klonlama sistemi kullanılarak. Saflaştırılmış dβh PCR ürünü (172 ng / ul), 1 ul (150 ng / ul) pDONRP4-P1R donör vektörü 1 ul karıştırın (diğer ağ geçidi vektörleri Dr. Chi-Bin Chien, Univ cömert hediyeler birlikte. Utah) TE tamponu (pH 8.0), BP Clonase enzim karışımı 2 ul 4 ul, 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra bir sut TOP10 yeterli E. transform E. coli, üreticinin protokolüne göre yöntem. </li><li> Oluştur d βh: EGFP-MYCN transgenik adım 1.2&#39;de belirtilen 8 kullanarak rekombinant klonlama sistemi inşa. Her giriş klonunun 1 ul bir 5.2 kb dβh promoteri (dβh -pDONR P4-P1R yapısı), EGFP bir durdurma kodonu (pME-EGFP yapısı) eksik de dahil olmak üzere (150 ng / ml) ve insan MYCN cDNA karıştırın (cömert bir hediye Dr. Hogarty adlı Pennsylvania Çocuk Hastanesi&#39;nde, MYCN-pDONRP2R-P3 yapı), 1 ul bir I-SceI tanıma sitesi (Dr. C. GRABHER, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) &#39;dan cömert bir hediye, TE tamponu 4 ul ihtiva eden tadil edilmiş hedef vektörünün (150 ng / | il), ( LR Clonase enzim karışımı 2 ul pH 8.0) içinde, 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra transforme kimyasal olarak yetkili E. E. coli gibi bir atış ilk 10 ve üreticinin protokolünü takip ediniz. </li><li> MITF edin: MITF transgenik PNP-MITF vektör sindirilmesi ile 8 inşa Notl ve SalI kısıtlama enzimleri ile 2 saat boyunca oda sıcaklığında ve serbest 2.65-kb alt-klonlanmasıyla (Dr. D. Raible, Univ cömert bir hediye Washington). MITF promotörünü ve çevreleyici bir I-SceI tanıma sitesi ihtiva eden bir tadil edilmiş pBluescript vektörü Notl ve Mlul mevkilerine zebra balığı MITF genin kodlama dizisini ihtiva eden bir DNA fragmanı (Dr. Hui Fe cömert bir hediyeng, Boston Üniversitesi) üreticinin protokolüne göre T4 DNA ligaz kullanılmıştır. NOT: stabil MYCN -expressing hatları üreten verimliliğini artırmak için d βh: EGFP-MYCN ve MITF:. MITF DNA yapıları tek hücreli aşamada sedef embriyolara birlikte enjekte edilir Sedef nöral eksik mutant balık türü belirler tepe-türetilmiş gelişim sırasında 36 melanofor. Böylece, enjekte edilen embriyolar pigment hücrelerinin görünümü MITF entegrasyonu önerir: MITF DNA genomuna oluşturur. Bu iki ya da üç birlikte enjekte DNA yapıları, balık genomuna 31 içine ko-entegre edilebilir gösterilmiştir. EGFP-MYCN transgen ve MYCN stabil bir transgenik çizgiden daha kolay tanımlama için: Bu nedenle, MITF sentezlenmesinin neden pigmentasyon dβh entegrasyonu için markör olarak görev yapabilir. </li><li> EGFP-MYCN ve MITF: d βh Mix MITF DNAI-SceI enzim 1 ul tampon maddesi ve 0.75 ul bir 15 ul reaksiyon toplam hacim içinde: 1 oranında 3 de yapıları. Reaksiyonda DNA toplam tutarı 750 ng geçmemesi emin olun. </li><li> 4 saat veya O / N için oda sıcaklığında I-SceI sindirimi yürütmek. İkinci günde,-SceI- DNA&#39;lar mikroenjeksiyon için hazır olan veya ileride enjeksiyon için -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir dijeste edilmiştir. Bunu, enzim etkinliğini korumak için küçük kısımlar halinde, -80 ° C&#39;de bir I-SceI enzim saklayın. </li><li> Dr. C. GRABHER (a cömert bir hediye bir pENTRY1A vektörünün EcoRI ve Notl mevkilerine pcDNA3 vektörü insan ALKF1174L ve vahşi tip ALK gen (Dana Farber Kanser Enstitüsü&#39;nde Dr. George cömert bir hediye) 7-klonlanmıştır, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) üreticinin protokolüne göre T4 DNA ligaz kullanılmıştır. </li><li> D βh oluşturun: ALKF1174L &lt;/ Em&gt; veya dβh: Protokolü 1.2 belirtildiği gibi rekombinant sistemini kullanarak ALKWT transgenik yapıları. Kısaca, üç giriş klonlar birleştirmek dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (veya ALKWT -pENTRY1A) ve P3E- poliA, I-SceI tanıma sitesi (Dr. C. GRABHER, Karlsruhe cömert bir hediye içeren değiştirilmiş hedef vektörüne Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) üreticinin protokolüne göre, LR Clonase enzim karışımı kullanılmıştır. </li><li> Karıştırın d βh: ALKF1174L (veya dβh: ALKWT) ve dβh: MCherry DNA 3&#39;te oluşturur: 1 oranında PROTOKOL 1,5-1,6 tarif edildiği gibi I-SceI enzim ile linearize. </li></ol> 2. Mikroenjeksiyon <ol><li> Tüm enjeksiyonlar 37 için, 1.0 mm çaplı cam mikropipetler kullanın. Enjeksiyondan önce bir jilet ile cam mikropipetlerin ucunu kırın. Inject enjeksiyon hacmi kalibremineral yağı, bir damla halinde H2O ing. Elde edilen damlacıkların çapı ölçülür ve enjeksiyon hacmi bir hücre aşamasında embriyoların toplam hücre hacminin% 10&#39;undan daha az olmasını sağlamak için mikroenjektör (basınç ya da basınç palsının süresini) ayarlayın. </li><li> DNA ihtiva eden enjeksiyon çözeltisi, 5 ul taze bir I-SceI enzim (5 ünite / ul) ilave 0.5 ul ekle enjeksiyon transgenesis 38 etkinliğini arttırmak için hemen önce oluşturur. Tek hücre aşamasında embriyoların sitoplazmasına Doğrusal hale getirilen DNA yapıları 50-80 pg enjekte edilir. Enjeksiyon başarısını sağlamak için, görselleştirme için% 0.25 fenol kırmızısı ile örnek karıştırın. Hücreler enjeksiyondan sonra kırmızı açarsanız, bu mikroenjeksiyon başarılı olduğunu gösterir. Transgenik balık üretmek için yüksek bir başarı oranı sağlamak için, biz genellikle 500 kadar embriyolar enjekte. </li><li> EGFP-MYC: stabil MYCN sentezleyen transgenik balık oluşturmak için, çizgiselleştirilmiş d βh birlikte enjekteK ve MITF: MITF DNA yapıları, (3: 1 oranında), bir hücre aşamasında pigmentasyon mutan sedef zebrabalıkları embriyolara. MITF ifadesi balık genomunda transgenik yapıların entegrasyonu için bir muhabir olarak hizmet vermektedir. </li><li> Dβh ile; ALK F1174L (ALKWT veya dβh:): yabani tipte veya MYCN transgenik embriyolar ALK mozaik aşırı ekspresyonu için, doğrusallaştırılmış d βh birlikte enjekte bir hücreye: MCherry DNA (1 oranında 3 de) oluşturur vahşi tip AB balık ile transgenik balık: F1 heterozigot Tg (EGFP-MYCN dβh) olarak ıslah kaynaklanan embriyolar. Bu nedenle, yavru yarısı MCYN için transgenik olan ve yarı vahşi tip bulunmaktadır. </li></ol> Kararlı ya da Mozaik Transgenik balık için 3. Ekran <ol><li> Tricaine (% 0,02) bir öncelikli olarak enjekte sedef embriyolar anestezi stabil MYCN -expressing hatlarının tespiti verimini arttırmakT gün pigmentasyon postfertilization ve ekranın 3-5. Germ hücreleri EGFP-MYCN transgenini: d βh taşıyan kurucu balık için daha fazla tarama için cinsel olgunluk onları taze yumurta su ile yeni bir petri pigmentasyon ile embriyolar transfer ve yükseltmek. </li><li> EGFP-MYCN, daha genotiplemede için 1-2 gün sonrası döllenme de EGFP-pozitif embriyolar için yabani tip AB balık ve ekran outcross pigmentli F0 yetişkin balık germ iletimi ile kurucusu tanımlamak için. PCR tüp içine tek bir EGFP-pozitif F1 embriyo yerleştirin ve tüm sıvı çıkarın. 4x liziz tamponu 12.5 ul, 35 ul H2O ve 2.5 | il proteinaz K tek embriyo (10 mg / ml) içeren gDNA ekstraksiyon tamponu 50 ul ekle. 4x liziz tamponu içinde 50 ml yapmak için K proteinaz inaktif için 98ºC inkübasyondan 10 dakika, ardından 55 ° C&#39;de 2-3 saat boyunca reaksiyonu, inkübe 1 M Tris, 500 ul (pH 8.4), 2.5 mL 1 M KCI tH 2 O o 47 ml NOT: F0 MYCN istikrarlı transgenik balık vahşi tip AB balık ile yetiştirilen sonra, yavruların hepsi pigmentli bulunmaktadır. Böylece, pigmentasyon MYCN- olumlu balık belirlenmesi için işaretleyici olarak hizmet edemez. MYCN transgenik balık iken, EGFP-MYCN füzyon proteini gibi ve soğanilikteki gibi üstün servikal ganglionlar ve sempatik zincirin sıralı segmental ganglion ve non-PSNS dopaminerjik nöronların sempatik nöronlar da dahil olmak üzere, PSNS ifade edilir kranial ganglion 8. Bu nedenle, EGFP ekspresyonu MYCN kararlı transgenik embriyo tanımlanması için bir markör olarak görev yapabilir. </li><li> Şablon olarak pigmentli F1 embriyo ekstre gDNA 2 ul kullanarak MYCN primerleri -test F1: 5&#39;-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3: 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 &#39;ve aşağıdaki program zekâh GC açısından zengin bir PCR Sistemi: 3 dakika için 95 ° C&#39;lik 1 döngü, 30 saniye için 95 ° C 25 döngü, 30 saniye için 58 ° C ve 3 dakika için 72 ° C. Genellikle, pigmentli embriyolar entegre MYCN transgenin varlığı MITF ve MYCN aşırı ifade fazla 6 kurucu balık bu yöntem ile belirlenmiştir emin olmak için tek eşleşme gelen 14-16 pigmentli embriyolar genotiplemesi. </li><li> EGFP-pozitif F1 embriyoların kalanını kadar kaldırın. Fin klip ayrıca balık içine MYCN transgen entegrasyonu onaylamak için yukarıdaki protokolü kullanılarak yaş 2-3 ay onları Genotip ve. F1 MYCN vahşi tip AB balık ile stabil transgenik balık Breed. ALK F1174L (veya dβh: ALKWT) dβh ile: doğrusallaştırılmış d βh Co-enjekte PROTOKOL 2.4 açıklandığı gibi MCherry DNA tek hücreli embriyolara oluşturur. </li><li> Sıralama deneyde embriyolar -expressing MYCN üç boyutlu bir flor kullanarak protokol 2.4 de tarifEscence mikroskop ve gün PSNS EGFP-MYCN ifadesi için postfertilization 1-3 öncelikle enjekte embriyolar ekran. Daha sonra, gün postfertilization 2-5 sırasında tricaine (% 0.02) ile embriyolar anestezi ve üç boyutlu bir floresan mikroskobu kullanılarak PSNS içinde mCherry sentezlenmesi göre yine bu MYCN- pozitif ya da negatif embriyolar sıralamak. mCherry sentezlenmesi mozaik birinci enjekte edilmiş hayvanların dokularında ALK birlikte ekspresyonuna için bir markör olarak görev yapar. Not: ALK F1174L ve dβh: mCherry, dβh: ALKWT ve dβh: mCherry veya dβh vahşi tip balık MYCN kararlı transgenik balık üretimi kaynaklanan ~ 600 yavru d βh de dahil olmak üzere, doğrusallaştırılmış DNA yapısı ile, grup başına enjekte edilmiştir : MCherry tek başına, sırasıyla. MCherry mozaik ifadesi öncelikle enjekte balık 70-90% olarak görülebilir. Bir buçuk, bir-Enjekte balık üçüncü tümör izlemek için larva aşamasında kurtuldu. </li><li> MCherry + MYCN + ve mCherry + MYCN tüm toplamak - zebra balığı kitap 39, standart protokollere göre, embriyo ve 5 hafta postfertilization başlayarak tümör başlangıç ​​izler. </li></ol> Mozaik Transgenik balık 4. Tümör İzle <ol><li> Tümör başlangıcı kanıtı için 5 hafta postfertilization başlayan her 2 hafta mCherry- pozitif öncelikle enjekte balık izleyin. </li><li> MCherry varlığı için tricaine (% 0.02) ve ekranın balık anestezisi - ve EGFP dijital görme DS-U1 kamera ile donatılmış Nikon SMZ-1500 stereoskopik flöresanlı mikroskop altında PSNS tümörlerin -expressing. </li><li> Tümörler ALK transgen ifade olup olmadığını doğrulamak için, mCherry- ve ALK genotiplemesi PCR için EGFP-pozitif kitleleri izole. </li><li> PCR kullanarak, genomik DNA&#39;yı büyütmemiştirALK P7: 5&#39;-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 &#39;ve ALK P18: 5&#39;-TGT CAG CTT GCT GAT GTT GC-3&#39; ve aşağıdaki PCR reaksiyonu: 1 döngü, aşağıdaki primerler ile geliştirilen tümörleri ekstre 5 dakika boyunca 94 ° C, 30 döngü (30 saniye için 30 saniye için 94 ° C, 55 ° C ve 60 sn için 72 ° C). Daha sonra, sıra ALK P7 primeri ile PCR ürünü, bundan başka MCherry pozitif tümörlerde mutant veya yabani-tür ALK varlığını teyit etmek için. </li></ol>

<ol>
	<li>Tenesa, A., Dunlop, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+aetiology+of+colorectal+cancer+from+genome-wide+association+studies.">New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies.</a> Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).</li><li>Maher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+takes+centre+stage+in+cancer+profiling.">Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling.</a> Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).</li><li>Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+cancer+genomes+through+second-generation+sequencing.">Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).</li><li>Chung, C. C., Chanock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+genome-wide+association+studies+in+cancer.">Current status of genome-wide association studies in cancer.</a> Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).</li><li>Mosse, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ALK+as+a+major+familial+neuroblastoma+predisposition+gene.">Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene.</a> Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).</li><li>Janoueix-Lerosey, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+and+germline+activating+mutations+of+the+ALK+kinase+receptor+in+neuroblastoma.">Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).</li><li>George, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+ALK+provide+a+therapeutic+target+in+neuroblastoma.">Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+Collaborates+with+MYCN+in+Neuroblastoma+Pathogenesis.">Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Amatruda, J. F., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+cancer+in+zebrafish.">Genetic models of cancer in zebrafish.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).</li><li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299 (5608), 887-890 (2003).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphoblastic+lymphoma+cells+express+high+levels+of+BCL2,+S1P1,+and+ICAM1,+leading+to+a+blockade+of+tumor+cell+intravasation.">T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation.</a> Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).</li><li>Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+penetrant+melanoma+in+a+zebrafish+model+is+independent+of+ErbB3b+signaling.">Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).</li><li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing's+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis.">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).</li><li>Le, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock-inducible+Cre/Lox+approaches+to+induce+diverse+types+of+tumors+and+hyperplasia+in+transgenic+zebrafish.">Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RAS+on+the+genesis+of+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Genes &amp; development. 21 (11), 1382-1395 (2007).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KRAS+induces+progenitor+cell+expansion+and+malignant+transformation+in+zebrafish+exocrine+pancreas.">Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas.</a> Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmrk,+kras+and+myc+transgenic+zebrafish+liver+cancer+models+share+molecular+signatures+with+subsets+of+human+hepatocellular+carcinoma.">Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma.</a> PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).</li><li>Forrester, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9-transgenic+zebrafish+develop+a+myeloproliferative+neoplasm+and+provide+new+insight+into+mechanisms+of+myeloid+leukaemogenesis.">NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis.</a> British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).</li><li>Alghisi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogene+expression+to+endothelial+cells+induces+proliferation+of+the+myelo-erythroid+lineage+by+repressing+the+Notch+pathway.">Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway.</a> Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+responses+to+exogenous+DNA+in+mammalian+cells+and+its+effect+on+oligonucleotide-directed+gene+modification.">Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification.</a> Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+high-risk+neuroblastoma.">The genetic landscape of high-risk neuroblastoma.</a> Nature genetics. , (2013).</li><li>Berry, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK(F1174L)+mutation+potentiates+the+oncogenic+activity+of+MYCN+in+neuroblastoma.">The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma.</a> Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).</li><li>Heukamp, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+mutated+ALK+induces+neuroblastoma+in+transgenic+mice.">Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).</li><li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate.">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish.">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li><li>Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu temsili çalışmada, bu genler, belirgin bir şekilde bileşik kararlı transgenik balık coexpressing bizim önceki bulgusuyla tutarlıdır nöroblastom başlamasını hızlandırmak için işbirliği göstermek için transgenik balık -expressing MYCN içinde MCherry raportör geni ile geçici birlikte enjeksiyonu ve aktif ALK yakımının birlikte kullanılır Her iki ALK ve MYCN 8 aktif. Bu yöntem ile mozaik transgenik bir yaklaşım geleneksel bir yöntem...

Kanserler zamanla patolojik mutasyonlar, silmeler ve kromozom kazançları birikimi ile işaretlenmiş ilerici hastalıklardır. Bu genetik anormallikler, hipoksi gibi yanıtları stres hücre iskeletinin hücre döngüsü, hücre ölümü, enerji metabolizmasında ve montaj kadar çok sayıda hücresel süreçleri etkileyebilir. Bu nedenle, tümörigenezin biyolojik süreçlerin bir yelpazede çok sayıda genetik bozuklukların kolektif eylemleri yansıtır. Tüm genom dizileme, exome sıralanması, hedeflenen sıralama, derin sıralama ve genom dernek çalışmaları da dahil olmak üzere son bütünleştirici genomik araştırma çabaları, tümörlerin 1-4 esasen her türlü yeni genetik değişikliklerin giderek artan sayıda belirledik. Birçok durumda, genetik lezyonlar hastalığın patogenezinde işbirliğini düşündüren, bir rastgele olmayan bir şekilde 5-8 birlikte görülür. F Elde edilen anormal ifade edilen genlerin büyük bir dizi onkojenik rolleri KesmeBu genomik lezyonları rom, yeni tedavi stratejileri hazırlamak ve bu ajanların tümör hücrelerinin tepkilerini anlamak için gerekli, ancak bu yüksek verimli fonksiyonel genomik analiz yürütülmesinde çok sağlam hayvan modeli sistemleri gerektiren, zor bir görev olduğunu kanıtlamıştır vivo. Memeliler, özellikle kemirgenler, kanser biyolojisinde tercih modeller olmasına rağmen, Zebra balığı büyük ilgi çekmek için başlamıştır. Teleost zebra balığı (Dario rerio) 1960 yılından bu yana gelişim incelemesi için bir model organizma olarak kullanılmaktadır ve birinci 1982 9-11 tümör patojenez çalışma uygulanmıştır. Bakım, küçük vücut büyüklüğü ve yüksek doğurganlık kolaylığı Zebra balığı anormal ve patolojik fenotipleri 10 görüşmek mutasyonları tespit etmek büyük ölçekli ileri genetik ekranlar için sağlam bir model olun. Zebra balığı embriyolarının optik şeffaflık gibi, bu kanser modelinin daha geniş kullanımını destekleyen bir başka önemli özelliğiBu, gerçek zamanlı 9, kemirgen 12 nispeten zor bir uygulama, tümör gelişmesini bulmak için yapılacak in vivo görüntüleme sağlar. Zebra balığı referans genom (Zv9) son karşılaştırmalı genomik analiz,% 71% 82 Man (OMIM) veritabanında 13 Online Mendel Kalıtım hastalıkla ilişkili genleri ile ilişkili olan insan ortologlara, sahip, 26.206 protein kodlama genleri ortaya 14. Sonuç olarak, Zebra balığı nöroblastom 8 dahil olmak üzere insan kanserlerinin farklı tipleri, modellemek için kullanılır olmuştur, T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) 15,16, melanom 17,18, Ewing sarkomu 19, rabdomiyosarkoma 20,21, pankreas karsinomu 22, hepatoselüler karsinom 23 ve miyeloid 24,25 malignitesinin ve Ksenonakilden bir kanser modeli 11,26 çalışmalar olarak seçilmiştir. Stabil bir transgenikZebra balığı yaklaşım yaygın kazanç fonksiyon-normal gelişimi veya hastalık patogenezinde 27,28 genlerin etkisini incelemek için kullanılır. Bu tip bir model (Şekil 1A) geliştirmek için, bir tek hücreli vahşi tip embriyolara bir doku spesifik promotör tarafından sürülen ilgili geni içeren bir DNA yapısı enjekte eder. Enjekte embriyolar cinsel olgunluğa ulaştığında Üç dört ay enjeksiyondan sonra, onlar kurucu balık olarak lisansları onların germline içinde inşa DNA entegrasyonu gösteren olanlar için ekrana vahşi tip balık çaprazlanırlar. Bu tür kopya sayısına ve transgen entegrasyonu alanı olarak bir çok faktör, kararlı transgenik hatlarda transjenin ekspresyonunu etkilemektedir. Bu nedenle, transgenik bir tümör modeli geliştirmek için, tek bir onkojenini aşırı ifade çok kararlı transgenik çizgiler, ilk oluşturulan ve tümör indüksiyonu yol açacak bir seviyede transgen ifade hattı için taranması gerekecektir. Fakat, eğer bir aday o aşırı ekspresyonuncogene germ hücreleri için toksik olan, doğrudan transgen 29 aşırı eksprese eden stabil bir transgenik çizgiden üretmek zordur. Dolayısıyla, bu yaklaşım uygun bir kanser modeli oluşturmak için başarısızlık riski yüksek olan, zaman alıcı olabilir. Burada, in vivo fonksiyonel genomik çalışma için geleneksel sabit transgenesis benzersiz avantajlar sağlamaktadır mozaik geçici transgenezi (Şekil 1B) dayalı bir alternatif strateji göstermektedir. Bu yaklaşımda, bir veya daha fazla transgen yapıları transgenik ya da vahşi türdeki embriyo tek hücreli aşamada enjekte edilir. transgenleri ihtiva eden enjekte DNA yapıları, tek tek balık 30, çok hücreli bir popülasyon içindeki karıştırılmış genotipler ile sonuçlanan, daha sonra mosaically rastgele primer enjekte balık entegredir. Ayrıca, birden fazla DNA ko-enjeksiyon tek hücreli embriyolar yapıları birlikte entegrasyon rasgele sitelerde aynı hücreye, Tra için izin açarTransjenlerin hücreleri ce ve mozaik hayvanlarda 31 hastalık patogenezi sırasında farklı genlerin etkileşimi keşfetmek. Prensip kanıtı olarak, geçici olarak doğal tipte balık ve MYCN ifade eden transjenik balık dopamin beta hidroksilaz (d βh) promoteri kontrolü altında, periferal simpatetik sinir sistemi (PSNS) &#39;de MCherry raportör geni ile mutationally aktive ALK (F1174L) aşın. bir reseptör tirosin kinazını kodlamaktadır ALK, yüksek riskli nöroblastom 5-7,32,33 de en sık mutasyona genidir. ALK en yaygın ve potansiyel somatik aktive mutasyonlar olarak (F1174L), temsil edilen aşırı bir MYCN- yüksek riskli hastalar nöroblastom büyütülmüş ve stabil bir transgenik fareler ve transjenik zebra balığı model 8,34,35 hem de nöroblastom tümörogenez hızlandırmak için MYCN aşırı ekspresyonu ile sinerjize etmektedir. Mozaik tarafındanMYCN transgenik balık mCherry ile ALK (F1174L) geçici olarak aşın, mozaik transgenezi stratejisi için hızlı ve etkili bir şekilde kullanılabileceğini düşündüren, ALK (F1174L) ve MYCN hem aşırı ifade eden stabil transgenik balık gözlemlenen tümör başlangıç ​​ivme değinmeyecek in vivo tümör başlatılması birden onkojenlerin göreceli katkıları değerlendirmek.

<table><tbody><tr><td>Expand Long Template PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>pCR-TOPO vector&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, CA</td><td>451641</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II enzyme&lt;br/&gt; Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;reg; BP Clonase&amp;reg; II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>GC-RICH PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>12 140 306 001</td><td></td></tr><tr><td>Meganuclease I-SceI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon digital sight DS-U1 camera</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Mutationally aktif ALK F1174L veya vahşi tip ALK aşın nöroblastom indüklenmesinde MYCN ile işbirliği olup olmadığının araştırılması için, MYCN ifade eden transjenik balık PSNS d βh promoterinin kontrolü altında aktive edilmiş insan ALK ya da vahşi-tipli insan ALK ya aşın. ALKF1174L veya dβh - - aşağıdaki yapıları, dβh herhangi biri ALKWT, dβh ile birlikte enjekte edildi - mCherry te...

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis at JoVE.com

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi için Mozaik Zebra Balığı Transgenezi | Gelişim Biyolojisi | Video

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-functional-genomic-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Genetics

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

11.1K Görüntüleme.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Video: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Kanser Araştırmaları

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Tıp

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Gelişim Biyolojisi

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Biyoloji

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

Mozaik Zebra balığı Transgenesis Enhancer Diziler değerlendirilmesi için

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Verimli In Vivo Tümör Çalışmaları için Larva Zebra Balığının Kullanılması

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Yazar Spotlight: Zebra Balıklarında Tümör Ksenotransplantasyonu Kullanarak Kanser Terapötiklerini İlerletmek

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Mozaik Zebra balığı Transgenesis Enhancer Diziler değerlendirilmesi için

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem