La expansión del código genético, o GCE, supera las limitaciones de otras estrategias de etiquetado. Nos permite ubicar proteínas específicamente etiquetadas, y tenemos fluoróforos orgánicos brillantes que permiten su visualización, por lo que podemos evitar estrategias que hacen, por ejemplo, fusiones de proteínas fluorescentes, que pueden interrumpir la función de las proteínas. Este método se puede aplicar a cualquier otro sistema.
Por ejemplo, lo hemos utilizado para etiquetar la proteína CO del Zika, y eso nos permite proporcionar y producir el virus del Zika etiquetado que luego podemos observar infectando las células huésped. Para comenzar, transfiera 100 microlitros de cultivo primario a cinco mililitros de medio LB que contenga 35 microgramos por mililitro de cloranfenicol y 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incubar a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,6.
Reemplace el medio LB con el medio N-mínimo modificado suplementado con un TCO milimolar, un aminoácido no canónico. Y cultive las bacterias a 34 grados centígrados durante 30 minutos. Agregue 0.2% de arabinosa, 25 miligramos por mililitro de cloranfenicol y 100 miligramos por mililitro de ampicilina, y haga crecer las células durante otras seis horas, agitando a 250 RPM.
Después de seis horas, lave las bacterias cuatro veces en un intervalo de 30 minutos con medios frescos de MgM sin aminoácidos no canónicos o ncAA. Centrifugar las bacterias, volver a suspenderlas en tampón PBS e incubar durante una hora a cuatro grados centígrados en la oscuridad para eliminar el exceso de ncAA. Después de una hora, centrifugar las bacterias a 3, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, y almacenarlas para su uso posterior.
Para un experimento de control, repita el mismo experimento expresando proteínas portadoras de ncAA en ausencia de ncAA. Resuspender las células de salmonela que expresan SseJ incorporadas con TCO en ausencia o presencia de TCO en PBS. Ajustar la densidad óptica de 600 nanómetros a cuatro en PBS, e incubar las células con 20 tetracenos micromolares Janelia Fluor 646 o 20 micromolares BDPFL tetrazina a 37 grados Celsius en la oscuridad, y agitar durante una o dos horas a 250 RPM.
Granular las células y lavar de tres a cuatro veces con PBS que contiene 5% DMSO y 0,2% Pluronic F-127. Vuelva a suspender el pellet en PBS que contenga 5% de DMSO. Después de incubar durante la noche a cuatro grados centígrados en la oscuridad, lavar dos veces más con PBS.
Obtener imágenes de las células inmediatamente usando un microscopio confocal, o fijarlas con paraformaldehído al 1,5% en PBS durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Cultivar y mantener las células HeLa a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad en DMEM de alta glucosa suplementado con 10% FBS además de estreptomicina penicilina. Cultive bacterias un día antes de la infección e inocule una sola colonia de salmonela de tipo salvaje que alberga plásmido pEVOL que contiene par ortogonal de ARNt sintetasa y plásmido pWSK29 que contiene el gen SseJ en cinco milímetros de caldo LB estándar que contiene antibiótico durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM.
Reparar un stock celular diluido a 100, 000 células por mililitro y sembrar 50, 000 células HeLA por pocillo en 500 microlitros de DMEM que contiene 10% de medio de crecimiento FBS en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos. Mantenga el portaobjetos de la cámara en una incubadora durante 24 horas a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Para la infección bacteriana, subcultive salmonela de tipo salvaje que alberga plásmido pEVOL y plásmido pWSK29 que contiene el gen SseJ diluyendo 100 microlitros de cultivo bacteriano durante la noche en tres mililitros de medio LB que contiene 35 microgramos por mililitro cloranfenicol y 100 microgramos por mililitro de ampicilina.
Incubar a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM durante cinco a siete horas. Para iniciar la infección de células HeLa, después de sacar las células HeLa de la incubadora, lave las células con DPBS precalentado y agregue 500 microlitros de DMEM fresco que contiene 10% FBS a cada pocillo. Coloque la cámara deslizante de nuevo en la incubadora de dióxido de carbono hasta que comience la infección.
Después de cinco a siete horas de incubación, diluya el cultivo de salmonela para que la densidad óptica a 600 nanómetros sea de 0.2 en un mililitro de medio de crecimiento DMEM, y agregue las cantidades requeridas del inóculo de salmonela a cada pocillo del portaobjetos de la cámara, de modo que la multiplicidad de infección sea 100. Después de incubar las células infectadas en una incubadora de dióxido de carbono durante 30 minutos, lave las células tres veces con DPBS precalentado para eliminar la salmonela extracelular. Establezca este punto de tiempo en cero horas después de la infección y agregue 500 microlitros de medio completo que contenga 100 microgramos por mililitro de gentamicina durante una hora.
Después de la incubación, nuevamente, lave las células tres veces con DPBS como se mostró anteriormente y agregue 500 microlitros del medio completo suplementado con 0.2% de arabinosa, 10 microgramos por mililitro de gentamicina a cada pocillo del portaobjetos de la cámara. En un experimento de control, realizar infecciones similares de células HeLa sin TCO. Después de incubar el portaobjetos de la cámara durante 10 horas en la incubadora de dióxido de carbono, reemplace el medio completo con medio completo fresco sin TCO y lave las células HeLa cuatro veces durante un intervalo de 30 minutos cada una con DPBS precalentado.
Luego lave las células con un medio fresco completo sin TCO. Después de 12 horas después de la infección, aspire el medio de las células y lave la celda con DPBS precalentado dos o tres veces. En un grupo de pocillos, agregue 500 microlitros de la mezcla de solución de colorante uno, y en otro grupo de los pocillos de la misma cámara portaobjetos, agregue 500 microlitros de la mezcla de solución de colorante dos.
Coloque la cámara deslizándose de nuevo en la incubadora de dióxido de carbono durante una y 1/2 a dos horas. Después de 13.5 a 14 horas después de la infección, enjuague las células HeLa dos veces con DPBS precalentado y agregue 500 microlitros de DMEM fresco suplementado con FBS. Después de incubar durante 30 minutos, lave las células nuevamente con DPBS precalentado como se mostró anteriormente, y luego lave con DMEM fresco cuatro veces durante un intervalo de 30 minutos.
A las 16 horas después de la infección, fijar las células HeLa con paraformaldehído añadiendo 200 microlitros de paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Aspirar fuera del paraformaldehído. Enjuague tres veces con PBS y guarde las células en PBS a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
Lleve las células al microscopio y coloque la cámara de imágenes en la etapa del microscopio en el soporte de la muestra. Luego cambie el medio en el pozo con 0.4 mililitros del tampón de imágenes GLOX BME recién hecho. Disminuya la potencia del láser a alrededor de un milivatio para identificar una célula HeLa de interés y ajuste el plano focal y el ángulo del rayo láser mientras ilumina la muestra con densidades láser bajas de 647 nanómetros.
Ajuste el ángulo de iluminación HILO. Capture una referencia a la imagen limitada de fracción de la estructura objetivo y cambie los fluoróforos al estado oscuro girando el láser a su máxima potencia. Ajuste la ganancia del preamplificador a tres y active la transferencia de trama.
A continuación, establezca la ganancia EM en 200 para una mayor sensibilidad en las mediciones de dSTORM. Ajuste la fuerza del láser a un nivel adecuado donde los eventos de parpadeo estén separados en el espacio y el tiempo. Establezca el tiempo de exposición en 30 milisegundos y comience la adquisición.
Adquirir 10, 000 a 30, 000 marcos. Repita la adquisición similar con diferentes ROI. Para la reconstrucción de imágenes de dSTORM, abra la imagen J e importe los datos sin procesar.
Abra el complemento Thunderstorm y configure la configuración de la cámara correspondiente al dispositivo. Vaya a ejecutar el análisis y establezca la configuración adecuada, como el filtrado de imágenes, los métodos de localización y la localización de subpíxeles de las moléculas. Haga clic en Aceptar para iniciar la reconstrucción de la imagen y comenzar el análisis de resultados finales posteriores al procesamiento.
Las salmonelas que expresan SseJ incorporadas con TCO se tratan con tetrazina Janelia Fluor 646 y se visualizan con fluorescencia Janelia Fluor 646 en ausencia o presencia de TCO. La fluorescencia de SseJ se detecta solo cuando el TCO está presente. Las células HeLa están infectadas con salmonela que alberga psseJ-HA durante 16 horas, fijadas e inmunoteñidas con anticuerpos anti HA, LPS y DAPI.
Como era de esperar, los filamentos inducidos por salmonela dependientes de SseJ, o SIF, se forman en las células infectadas. En ausencia de TCO, el codón ámbar no se suprime, y los SIF dependientes de SseJ están ausentes en las células HeLa infectadas. Los SIF dependientes de SseJ se observan en presencia de TCO, lo que indica claramente que SseJ fue rescatado por la expresión de SseJF10TCOHA utilizando la expansión del código genético, o GCE.
Aquí se muestra la especificidad del etiquetado de SseJF10TCOHA secretada en células HeLa a través de reacciones de clic SPIEDAC utilizando dos mezclas de colorantes alternativas, una y dos mezclas de colorantes. El colorante de clic Janelia Fluor 646 TZ se utilizó además para observar si había algún etiquetado de fondo en las células HeLa infectadas con Salmanella de tipo salvaje portadoras de SseJ HA en presencia de plásmido de bóveda TCO y P. SseJ se liberó en el citoplasma de la célula huésped sin señales fluorescentes intracelulares o no específicas, lo que demuestra que la señal fluorescente era específica de SseJ.
En esta figura se presentan imágenes de súper resolución de GCE etiquetadas con SseJ en células HeLa. Aquí se muestra una imagen de campo claro de una célula HeLa bajo observación. Aquí se presenta la imagen de campo amplio limitada por difracción de SseJ secretada etiquetada con TCO y Janelia Fluor 646 y la imagen dSTORM correspondiente de los SIF decorados con SseJ.
El inserto muestra una vista ampliada de un SseJ súper resuelto en la región en caja. Las soluciones de stock de la NCAA se prepararon en NaOH. No olvide neutralizarlo antes o después de la adición a los medios.
Después de etiquetar la proteína de interés, lave la celda extensamente, de modo que la señal de fondo sea mínima. Siguiendo nuestro procedimiento de GCE, ahora, podemos etiquetar cualquier factor de virulencia en bacterias y seguir su actividad utilizando nuestras técnicas de imagen.
