PCLS, neredeyse bozulmamış bir doku ortamında hava yolu ve vasküler düz kas hücresi aktivitesinin değerlendirilmesini destekler, böylece pulmoner araştırmalar için paha biçilmez bir ex vivo model sağlar. Düz kas araştırması açısından, hassas kesilmiş akciğer dilimleri, düz kas hücrelerinin in vivo fenotipini ve çevre yapılarla etkileşimlerini korurken, hücresel düzeyde mekanik bir çalışma için önemli olan düz kas hücresine erişime izin verir. Başlamak için, fare gövdesini sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtasına yerleştirin.
Kuyruğu, ön pençeleri ve kafayı 25G şırınga iğneleriyle sabitleyin ve% 70 etanol ile vücudu sterilize edin. Göğüs boşluğunu, diyaframın üzerindeki sternum ve bilateral inferior göğüs kafesi boyunca dikkatlice açın. Ardından, keskin makas ucunu akciğer dokusundan uzağa doğrultun ve kalbi açığa çıkarmak için bilateral ventral göğüs kafeslerinin bir kısmını çıkarın.
Göğüs boşluğu açıldığında akciğer loblarının çöktüğünü gözlemleyin. Trakeayı açığa çıkarmak için fare boynundaki yumuşak dokuyu çıkarmak için makas kullanın. Trakeanın üst ucunda, 20G Y şeklinde bir IV kateter ucunun geçmesine izin vermesi gereken 1.2 milimetre çapında küçük bir delik açın.
Y şeklindeki kateterin bir adaptör portunu 0,5 mililitre hava ile önceden doldurulmuş 3 mililitrelik bir şırıngaya ve diğer portu 42 santigrat dereceye ısıtılmış 2 mililitre% 1,5 agaroz çözeltisi ile önceden doldurulmuş 3 mililitrelik bir şırıngaya bağlayın. Kateteri doldurmak için agaroz çözeltisi enjekte edin ve ardından kateteri açıklıktan trakeaya 5 ila 8 milimetreye kadar itin. Agaroz çözeltisini 5 saniyede 1 mililitre oranında yavaşça enjekte edin.
Akciğerin proksimal ila distal eksen boyunca genişlediğini gözlemleyin. Her akciğer lobunun kenarı şişirildiğinde enjeksiyonu durdurun. Daha sonra, artık agarozu distal alveol boşluğuna iletken hava yollarına itmek için diğer şırıngadan 0.2 ila 0.3 mililitre hava enjekte edin.
Klips trakeayı bir çift kavisli hemostatik forseps ile kapattı. Pulmoner vaskülatürü doldurmak için, 1 mililitrelik bir şırıngayı sıcak% 6 jelatin ile doldurun ve bir iğne derisi damar kateterine bağlayın. Kateteri jelatin çözeltisi ile doldurun ve ardından sağ ventrikülü iğne ile inferior duvara yakın bir yerde delin.
İğneyi 2 ila 3 milimetre boyunca sağ ventriküle itin ve iğne ucunu ana pulmoner artere doğrultun. Yaklaşık 0.2 mililitre jelatin çözeltisini yavaşça sağ ventrikül ve pulmoner arteriyel damarlara enjekte edin. İğneyi enjeksiyondan sonra beş dakika yerinde tutun ve kalp ve akciğere buz gibi soğuk HBSS çözeltisi dökerek akciğer loblarını soğutun ve vücudu bir buzdolabına koyun.
Bu adımdan sonra, fare akciğerini ve kalbini çevredeki bağ dokularından makasla çıkarın. Daha sonra, her akciğer lobunu ayırın ve buz üzerinde HBSS çözeltisinde saklayın. Akciğer lobunu kesin ve kesme yönü hiladan akciğer yüzeyine kadar çoğu hava yoluna dik olacak şekilde yönlendirin.
Numune sütununun üstüne süper yapıştırıcı ile takın. Akciğer lobunu 150 mikrometrelik dilimler halinde kesmek için taze ince bir tıraş bıçağı ile bir vibratom kullanın. Dilimleri soğuk HBSS çözeltisi ile önceden doldurulmuş steril Petri kaplarında toplayın.
Dilimleri DMEM/F-12 kültür ortamı ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın. Bulaşıkları deneylerden önce gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. HBSS ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir kültür plakasının her bir kuyucuğuna tek bir hassas kesimli akciğer dilimi yerleştirin.
Dilimi kuyucuğun ortasına yerleştirin ve ardından HBSS solüsyonunu bir pipetle çıkarın. Bir mikroskop altında, hedef hava yolunu ve damarı dilimde bulun ve daha sonra hedeflenen hava yolu gemi alanını ortaya çıkarmak için önceden kesilmiş merkezi bir deliğe sahip naylon bir ağ kullanarak örtün. Dilimleri yerinde tutmak için ağın üstüne içi boş bir metal yıkayıcı koyun.
Ardından, dilimleri batırmak için 600 mikrolitre HBSS çözeltisi ekleyin. 10 dakika sonra temel görüntüleri kaydedin. Hava yolunu veya vasküler kasılmayı indüklemek için, HBSS çözeltisini bir pipetle dikkatlice çıkarın ve bir agonist ile 600 mikrolitre HBSS ekleyin.
Kalsiyum boya yükleme tamponunu hazırlamak için, önce 10 mililitre DMSO içinde 10 mikrolitre DMSO ve 0.2 gram Pluronik F-12 tozu ile 50 mikrogram boya çözün. Pluronik çözeltinin 10 mikrolitresini 10 mikrolitre kalsiyum boya çözeltisi ile karıştırın. Bu karışımı 200 mikromolar sülfobromoftalin içeren 2 mililitre HBSS çözeltisine ekleyin.
Daha sonra, 2 mililitre kalsiyum yükleme tamponuna 15 hassas kesilmiş akciğer dilimi yerleştirin ve bir saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin, ardından 30 dakika boyunca 100 mikromolar sülfobromoftalin içeren HBSS'de inkübe edin. Ardından, kalsiyum boya yüklü dilimleri büyük bir kapak camına yerleştirin. Yüksek vakumlu silikon gresi, 18G künt iğneye bağlı 3 mililitrelik bir şırıngaya veya 200 mikrolitrelik pipet ucuna doldurun ve kapak camı boyunca, dilimin üstünde ve altında iki paralel çizgi çizin.
İki gres hattı arasında naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün. Bir oda oluşturmak için ikinci kapak camını ağın üzerine yerleştirin. HBSS veya agonist solüsyonu hazneye bir ucundan pipetle ekleyin.
Diğer ucundan kağıt mendil ile emerek sıvıyı odadan çıkarın. Dilimin haznesi artık yüksek hızlı lazer taramalı konfokal mikroskopla kalsiyum görüntüleme için hazırdır. Pulmoner hava yolu arter demetleri, faz kontrast mikroskobu altında 150 mikrometre kalınlığında hassas kesilmiş akciğer dilimlerinde gözlendi.
İstirahat halindeyken, yakındaki bir pulmoner artere sahip küboidal epitel hücreleri tarafından bir hava yolu tanımlandı. Metakoline maruz kaldıktan sonra, pulmoner arter uyaranlara yanıt göstermezken, luminal alan azaldı. Hava yolu kontraktil yanıtları, luminal alan azalmasının yüzdesi ile ölçüldü ve bir günlük ve beş günlük kültürlerde benzer doza bağımlı yanıtlar gösterdi.
Periferik akciğer alanına ulaştıktan sonra, iletken hava yolları solunum kanallarına ve küçük intraasinar arteriolleri çevreleyen keselere dallanır. Endotele maruz kaldığında hem hava yolları hem de pulmoner arterler daralır, bunu NOC-5 kaynaklı gevşeme izler. İstirahat halinde, kalsiyum boya yüklü dilimler, konfokal floresan mikroskop altında hava yolu ve vasküler sistemin düz kas hücrelerinde düşük floresan gösterdi.
Agonistlere maruz kaldıktan sonra, kalsiyum floresan yoğunluğu hücrelerde yükseldi ve salınım sinyalleri ile ilişkili olan tüm hücreye yayıldı. Teknik olarak, akciğeri agaroz ile homojen bir şekilde şişirmek ve hızlı veya aşırı agaroz enjeksiyonundan kaçınmak esastır. Agarozu iletken hava yolundan distal alveol boşluğuna temizlemek için daima havayı sonuna doğru itin.
Özetle, hassas kesilmiş akciğer dilimleri kültürünü kullanarak, özel bir pulmoner düz kas fonksiyonu çeşitliliği sağlanabilir ve düz kas deregülasyonunu in vitro olarak modelleyebilir. Ayrıca novo vazodilatatör veya bronkodilatör ilaçları taramak için ideal bir platform sağlar.
