Biz mikroskobu ile yardım için Jeff Tucker, Erica Scappini ve Agnes Janoshazi ederim, eleştirel okuma fare kolonisinin onun yönetimi için Ligon Perrow ve Jun Chen ve Michael Sanderson doku dilimleme makinesi ile yardım ve Michael Fessler ve Derek Cain el yazması. Bu çalışma da Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı tarafından desteklenmektedir NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), intramural dalı tarafından finanse edildi.

Bu yazıda anlatılan Hayvan deneysel prosedürler NIEHS Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Akciğer hazırlanması <ol><li> Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak spesifik patojen free koşullarda yaş 6 ve 12 hafta arasında Ev fareleri. NOT: görüntülenmistir fareler her araştırmacının ilgi alanlarına bağlı olarak naif veya tedavi olabilir. Burada, 50 uL bir toplam hacimde bir taşıyıcı olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanılarak, naif farelerde ve 100 ug ovalbumin (OVA) ve 0.1 ug lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edilen farelerde bağışıklık hücresi lokalizasyonunu tarif etmektedir. oropharyngeally solunum yolları içine OVA / LPS aşılamak için, hayvanlar izofluran teneffüs ile anestezi uygulandı ve dikey olarak bir lastik bant ile dişleri ile süspansiyon haline getirildi. dil forseps ile yavaşça tutulur ve yutma önlemek için bir tarafa yapılan ve 50 # edildi181; ağız boşluğu arka biriken OVA / LPS çözeltisi L önceden 17 tarif. </li><li> sodyum pentobarbital (100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile fare euthanize ve polistiren tabanına hayvan pin. </li><li> çeneye karın kadar ortasından deri ve periton keserek makas ile karın boşluğuna açın. forseps veya makas donuk kenarı ile bir kenara bağırsak çekin ve akciğer uzak kan akıtmak için inferior vena cava makasla kesme. akciğerler kesmek için dikkatli olmak göğüs kafesinin genişlemesine izin vermek üzere makas sivri ucu ile diyafram ile delikler. </li><li> Şeffaf tükürük bezleri ve forseps ile altta yatan trakea uzak çekerek manuel dokuyu kapma ve uzakta trakeadan diğer doku. tra olsa tüm yol kesmek için dikkatli olmak, ince forseps veya makas kullanılarak kıkırdak en kalın bandın ön tarafında Nefes borusunda küçük bir kesi olunChea. kesik, bir 20 G iğne ile geçmesine imkan vermek için yeterince büyük olmalıdır. </li><li> iğnenin ucundan ileriye boru, yaklaşık 1 cm bırakarak, polietilen boru donanımının bir bölümü üzerine bir 1.5 inç, 20 G iğne kaydırın. agaroz kadar iğne içinden sıcak 0.8 mL (40 ° C),% 2 düşük bir erime noktasına çizerek şırınga, son konik bir 1 ml şırınga iğne takılır ve yük için yaklaşık 45 ° &#39;lik bir açı ile hortumu kesilir. </li><li> Trakea kesi içine boru ucunu yerleştirin ve yavaş yavaş akciğerlere agaroz enjekte edilir. iğne ya da şırınga hareket olmadan, iğne trakeanın kalmasını sağlamak için polistiren tabanına şırınga bantlayın. NOT: Enjeksiyondan sonra, akciğerler göğüs içinde büyük ve şişirilmiş olacaktır. Doğru lob, ilk önce sol lobu genişletin. Sadece bir lob genişletir, iğne (bronş geçen) çok derin olarak yerleştirilen edilmiş ve devam etmeden önce hafifçe çekmek için gerekli olacaktır. bu bölümüProsedür agaroz katılaşmaya başlamadan önce, nispeten hızlı bir şekilde yapılması gerekir. </li><li> En az 10 dakika süreyle bir baz ve bir soğuk odada yine hava borusu içinde yerleştirilmiş bir şırınga ya da buzdolabı, fare yerleştirin. Gerekirse, hayvan birkaç saate kadar, hatta video mikroskobu ile görüntü hücre göçü geçmeden eğer orada tutulabilir. </li><li> Fare soğuk sonra, dikkatli bir şekilde makas kullanılarak agaroz şişirilmiş akciğerler eksize ve buz gibi soğuk PBS ile 3 cm uzunluğunda bir tabağına yerleştirin. buz üzerinde tutun. </li><li> Doku dilimleme için istenen lobu (örneğin sağ superior lob) seçin. Emin (o trakea bağlanır) akciğerin iç kısmı tabak yüz aşağı olduğundan emin olun. Not: lob kullanılmıştır ve pistonu oryantasyon görünür olacak damar ve solunum yollarının boyutunu belirleyecektir. Burada anlatılan oryantasyon büyük hava yollarının görselleştirme ve parankimindeki için idealdir. Fareler bir büyük sol lobu ve sağda dört küçük dilimleri vardır. İçinuygun bir boyut olduğu için değil, aynı zamanda inhalasyon ajanları içindeki eşit dağılması nedeniyle orofaringeal veya intranazal aspirasyon yoluyla akciğerlere alerjenlere açıklanması sonrasında PCLS görüntüleme, sağ superior lob genellikle kısmen kesitli edilir. Ancak, diğer lob, özellikle sol lob da incelenebilir. Fare suşları veya tedaviler karşılaştırırken, aynı lobu karşılaştırmak önemlidir. </li></ol> 2. Akciğer Dilimleme NOT: üreticinin talimatlarına göre metal blok, pistonu ve metal şırınga soğutma, otomatik dilimleme makinesi kullanılarak dilimleri olun. <ol><li> Pistonun üzerine çok amaçlı küçük bir damla, hiçbir işletilen jel superglue koyun ve tutkal metal şırınga kenarlarına dokunmasına izin için özen, dairesel bir hareketle tutkal yayıldı. tutkal, şırınganın tarafı ile temas ettiği şırınga tutkal ve dalma pistonunu olacaktır. </li><li> Hemen yapıştırıcı ile piston kapsayan sonra, yavaşça kavramakAşağı trakea tarafı forseps ile eksize lob, fazla sıvının çıkması, ve dikkatli bir şekilde pistonun üzerine yerleştirmek için bir doku üzerine hafifçe sürün. Pistonun kenarının ötesine uzanan herhangi bir ilave dokusu kesin. </li><li> Metal şırınganın kenarları yukarı ve doku üzerinde, böylece oluşturma aşağı pistonu hareket iyi derin birkaç santimetre daha fazla, alt yapıştırılmış akciğer. Metal şırınga altındaki etrafında Teyp etapta bu konumda tutun. </li><li> sadece lobun üst kaplayacak şekilde dikkatli bir şekilde de içine, 40 ° C&#39;de,% 2 az eriyen agaroz dökün. </li><li> buz soğukluğunda soğutma bloğu metal şırınga Surround ve 1 lob ve agaroz serin - 2 dakika. Not: çevreleyen dokudan agaroz daha kısa bir zaman soğutma bir düzensiz kesme PCLS neden olabilir, dilimleme sırasında agaroz parçalanmasına neden olabilir. </li><li> Otomatik dilimleyicinin içine numune şırınga yükleyin ve buz PBS ile tampon tankı doldurun. hizalama<html> Numune şırınga ile motorlu sürücü adım ve alttan bant parçasını çıkarın. step motor sürücü sadece pistonun arkasına dokunana kadar hızlı ileri (FF) konumuna getiriniz. </li><li> Numune şırınga ile taze bıçak hizalayın. dilimleyici Set doku kalınlığı, sürekli / tek bir dilim, salınım ve hızı. Örneğin doku kalınlığı: 150 um, sürekli kesme (devam). salınım: 9, ve hızı: 3 - 4. başlar. Yukarıdaki ayarları belirli otomatikleştirilmiş dilimleyici özelliklerine ayarlanması gerekebilir. </li><li> bunlar tampon tankına dökülmesini ve buz soğuk PBS içeren bir 24-çukurlu plaka içinde koyun gibi ince bir spatula ya da fırça kullanılarak, her seferinde PCLS bir toplar. NOT: deneyler arasında tutarlılığı sağlamak amacıyla dilimleri tutmak önemlidir. Her akciğer, yaş, cinsiyet ve ağırlığına bağlı olarak farklı olmasına rağmen, 10. dilim, örneğin, genel olarak benzer solunum aygıtı elde edilir. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 3. Antikor Boyama <ol><li> ki potansiyel floresan spektral üste binme ve bir mikroskop tespit alma yetenekleri, ilgi konusu hücre türüne göre fluoresan ışığı ile işaretlenmiş antikor paneli tasarlama. NOT: Bir örnek olarak, DC alt seti tespiti için bir panel: CD11c / alfa X integrin - BrilliantViolet (BV), 605 (Uyarım: 405 nm, tepe emisyon: 605 nm), CD324 / E-kadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Uyarım 488 nm, tepe emisyon: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Fikoeritrin (PE) (Uyarım 561 nm, tepe emisyon: 578 nm), CD103 / alfa e integrin - Allofikosiyanin (APC), (Uyarım: 633 nm Peak emisyon: 660 nm). Floresans spektral görüntüleyici araçları (Malzeme listesi) panelleri tasarlamak üzere kullanılır. </li><li> istenen antikorları ihtiva eden bir antikor kokteyli olun. <ol><li> Statik PCLS görüntüleme için, 1.5 ml microcentrifu 800 uL boyama tamponu, 100 uL Fc blocker, 50 uL normal fare serumu ve 50 ul normal sıçan serumu eklemek1 mL toplam hacim için yükümlülüğüne tüpü. canlı hücre görüntüleme, yerine boyama tamponu% 10 FBS (Leibovitz-10) ihtiva eden 800 uL Leibovitz ortamı (1 kez) kullanın. </li><li> Her bir antikorun bir istenen son konsantrasyonunu ayarlamak için antikor ekleyin. 3 cm&#39;lik çanak antikor çözüm aktarın ve kullanıma hazır oluncaya kadar karanlıkta tutun. Not: (- 5 ug / mL, genellikle 1) son konsantrasyonları gerekir her bir antikor için optimize edilmesi. </li></ol></li><li> Bu tür büyük solunum yolları veya akciğer periferinde gibi ilgi, bir anatomik bölgenin bir PCLS seçin ve 1 ml antikor çözeltisi ihtiva eden 3 cm tabak içinde yer. </li><li> 30 ya da 60 dakika boyunca yavaş yavaş sallanan buz üzerinde karanlıkta leke PCLS,. </li><li> Statik PCLS görüntüleme için, canlı hücre görüntüleme için bölüm 4. geçin bölüm 5 geçin. </li></ol> PCLS 4. Statik Görüntüleme <ol><li> antikorlarla PCLS 60 dakika inkübasyondan sonra, t çanak antikor çözüm kaldırmak ve durulamao 1 mL buz gibi soğuk PBS ile iki kez dilimler. </li><li> 3 cm yuvarlak cam alt tabak üzerine pipetle 50 uL PBS ile yıkandı. Bir spatula ya da fırça kullanılarak, düz kadar yavaşça dilim manipüle damla lekeli PCLS transferi ve yayılmış. Bir pipet ile PBS çıkarın. dilim mümkün olduğu kadar düz olmalıdır. Yukarıdaki prosedürler photobleaching önlemek için hızla yapılması gerekir. </li><li> dilime oda sıcaklığı montaj orta 1 damla yerleştirilir ve hafifçe plakasının her bir oyuğuna, cam bir lamel bırakın. Görüntüleme önce bir saat kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta PCLS tutun. </li><li> Konfokal mikroskop altında görüntülerken, bir 20X objektif (Malzeme Listesi bakınız) kullanın. &quot;Dışbükey&quot; ayarında doku kenarlarını bulmak ve işaretlemek için &quot;çini&quot; aracını kullanın. Bu karo taramanın süresini azaltmaya yardımcı olacaktır. </li><li> z yığın aralığı belirlenmesinde, özellikle de kenarlarında, dilimin çok alanlarda kontrol grubu aralıkları buuygundur. NOT: z aralığı, doku tamamen düz bir şekilde almak çok zordur, çünkü dokunun kendisinin kalınlığından daha büyük olması gereken muhtemel olacaktır. dilim darbe ve eğrileri karşılamak için 250 um - Örneğin, bir 150 mikron kalınlığında PCLS ile, z-yığın aralığı muhtemelen 200 ayarlanması gerekecektir. 20X objektif ile 12 saat - z-yığın aralığı ve doku boyutuna bağlı olarak, her bir tam akciğer tarama 7 arasında sürer. Her akciğer tektir ve ayarları her deney için ayarlanmalıdır. </li></ol> PCLS 5. Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> antikorlarla PCLS 30 dakika inkübasyondan sonra, çanak antikor çözüm kaldırmak ve Leibovitz-10 soğuk 1 mL&#39;si ile iki kere dilimleri yıkayın. </li><li> Pipet taze 50 uL Leibovitz-10 bölmeli coverglass (8 yuva) uzunlamasına bir içine. , Orta PCLS aktarmak için bir spatula kullanın dilim düz olana kadar yavaşça manipüle ve yaymak. yukarıdaki prosedürlerihtiyaç photobleaching önlemek için hızla yapılacak. </li><li> Bir pipet kullanarak 50 mcL orta çıkarın. dilim mümkün olduğu kadar düz yatan tutulmayacaktır. Not: dilim kenarları bölmenin duvarına dikey olarak ters çevrilmiş durumunda kabul edilebilir bir durumdur. Bundan başka, eğer varsa, bir metal platin ağırlığı bir sonraki aşamaya geçmeden önce, dilim sabitlemek için kullanılabilir. kesilmiş ve küçük ağırlıkların içine bükülebilir platin tel biri, örneğin bağlı Malzeme Listesi bakınız. </li><li> 4 ° C soğuk oda içinde, bir faktör-düşük büyüme, 100 uL Leibovitz-10 ile fenol kırmızısı içermeyen hücre dışı matrisin 100 uL karıştırın. Bunun için önceden soğutulmuş pipet uçları kullanın veya hücre dışı matris ucu sertleşir. Not: matris ve ortamın Bu oran (1: 1), doku-kültür koşullarında PCLS basılı kadar yoğun bir jel oluşturur. </li><li> Yavaşça karıştırmak için matris pipet ve dikkatle jel lu üstüne gider emin olarak PCLS üstünde pipetdilim ng ve dilim jel üstünde yüzerek gelmez. Jel plakanın altına doğru aşağı PCLS ankraj, bir ağırlık olarak çalışması gerekir. </li><li> Dikkatli bir şekilde 37 ° C inkübatör odacıklı coverglass aktarmak ve matris ~ 5 dakika boyunca katılaşmaya sağlar. </li><li> Konfokal mikroskop önceden ısıtılmış aşamasında üzerine tüm odacıklı coverglass aktarın. görüntüleme boyunca 37 ° C&#39;de bölmeyi muhafaza edin. Leibovitz ortamı kullanıldığında CO2 kaynağı cep inkübasyon sırasında gerekli değildir. </li><li> çerçeveler arasında arzu edilen aralığına göre z-yığın aralığı ve kiremit aralığını ayarlayın. konfokal mikroskop altında görüntülerken, bir 20X objektif (Malzeme Listesi bakınız) kullanın. (Örneğin, bir 2x2 merkezli ızgara) &quot;merkezli grid&quot; ayarını kullanarak, dokuda ilgili bölgeyi belirtmek için &quot;çini&quot; aracını kullanın. </li><li> z yığın aralığı ayarı da, ayar aralıkları uygun dilimin çok alanlarda kontrol edin. NOT: zrange dokunun kalınlığını eşit olasılıkla. Her akciğer tektir ve ayarları her deney için ayarlanmalıdır. 2x2 çini ve 10 Z-yığınları, genellikle yaklaşık 1 kare / 2 dakika ile sonuçlanacaktır. Emin olun otomatik odaklanma fonksiyonu görüntüleme döneminde xy ve z-sürüklenme en aza indirmek için deneye başlamadan önce devreye girer. </li></ol>

<ol>
	<li>Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+quantitation+of+eosinophil+and+neutrophil+recruitment+to+allergic+lung+inflammation+in+a+brown+Norway+rat+model.">Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).</li><li>Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+migratory+dendritic+cells+rapidly+transport+antigen+from+the+airways+to+the+thoracic+lymph+nodes.">Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes.</a> J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).</li><li>Sung, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+lung+CD103+(alphaE)-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins.">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).</li><li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lasker+Basic+Medical+Research+Award.+Dendritic+cells:+versatile+controllers+of+the+immune+system.">Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system.</a> Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).</li><li>Jakubzick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-migrating,+tissue-derived+dendritic+cells+are+minor+constituents+within+steady-state+lymph+nodes.">Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes.</a> J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).</li><li>Julia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+subset+of+dendritic+cells+captures+airborne+antigens+and+remains+able+to+activate+specific+T+cells+long+after+antigen+exposure.">A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure.</a> Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).</li><li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+properties+of+pulmonary+dendritic+cells+are+determined+by+their+developmental+lineage.">Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage.</a> Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).</li><li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+receptor+C5aR1/CD88+and+dipeptidyl+peptidase-4/CD26+define+distinct+hematopoietic+lineages+of+dendritic+cells.">Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells.</a> J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+lung+slices:+a+powerful+approach+for+assessment+of+lung+pathophysiology.">In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).</li><li>Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+tissue+slices:+applications+in+pharmacology+and+toxicology.">Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology.</a> Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).</li><li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+stimulates+Ca2++oscillations+and+contraction+in+airway+smooth+muscle+cells+of+mouse+lung+slices.">ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).</li><li>Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videomicroscopy+of+methacholine-induced+contraction+of+individual+airways+in+precision-cut+lung+slices.">Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices.</a> Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).</li><li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+testing+of+immune+responses+in+precision-cut+lung+slices.">Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).</li><li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+lung+function+measurements+in+precision-cut+lung+slices+(PCLS)+from+chemical+allergen-sensitized+mice+represent+a+suitable+alternative+to+in+vivo+studies.">Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies.</a> Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).</li><li>Paddenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+vasoconstriction+of+partial+muscular+intra-acinar+pulmonary+arteries+in+murine+precision+cut+lung+slices.">Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices.</a> Respir Res. 7, 93 (2006).</li><li>Wilson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+sensitization+through+the+airway+primes+Th17-dependent+neutrophilia+and+airway+hyperresponsiveness.">Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).</li><li>Schlitzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cDC1-+and+cDC2-committed+DC+progenitors+reveals+early+lineage+priming+at+the+common+DC+progenitor+stage+in+the+bone+marrow.">Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow.</a> Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).</li><li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+lymphatic+growth+in+bronchus-associated+lymphoid+tissue+in+sustained+lung+inflammation.">Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation.</a> Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).</li><li>Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+cell+antigen+1+(Thy1,+CD90)+is+expressed+by+lymphatic+vessels+and+mediates+cell+adhesion+to+lymphatic+endothelium.">Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium.</a> Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).</li><li>Truman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProxTom+lymphatic+vessel+reporter+mice+reveal+Prox1+expression+in+the+adrenal+medulla,+megakaryocytes,+and+platelets.">ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets.</a> Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).</li><li>Wigle, J. T., Oliver, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+function+is+required+for+the+development+of+the+murine+lymphatic+system.">Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system.</a> Cell. 98 (6), 769-778 (1999).</li></ol>

Yazarlar ilan etmek çıkar çatışması var.

Burada açıklanan protokol başlangıçta akciğer içinde CDCS iki alt kümelerinin yerleri görselleştirmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, hali hazırda hücre canlılığı ve akciğer üç-boyutlu yapısını muhafaza ederken, bir çok farklı hücre tipleri incelemek için adapte edilebilir. İkinci özellik hücre kültürü sistemleri üzerinden önemli bir avantaj olduğunu ve nadir hücre tiplerinin tanımlanması kolaylaştırır. yöntem, akciğer PCLS oluşturulmasına dayanır ve...

Bu tür lipopolisakarit (LPS) gibi pro-enflamatuar uyarılara solunması sonra, orada içinde, bağışık hücrelerin koordineli hareketi ve akciğer. Örneğin, nötrofiller hızla akciğer parankimi ve hava yoluna alınsın. Buna ek olarak, geleneksel bir dendritik hücreler (CDCS) olarak bilinen bir profesyonel antijen sunan hücreler, nispeten karmaşık göç desen, 1, 2 geçer. CDCS yüzey işaretleyici, kendi ekranında CD11c kısmen, akış sitometrisi kullanılarak tespit dayalı olabilir. DClerin Farklı alt-kümeleri CD103 ve CD11b 3 ayırıcı yüzey ifadesi ile ayırt edilebilir. Nefes yoluyla antijene aldıktan sonra, bir CDCS akciğer çıkmak ve antijen-spesifik T hücrelerinin 4 peptidleri sunan akciğer lenf düğümleri (LN) lenf damarları içinden yer değiştirmektedir. Bu adaptif bağışıklık r başlatılmasında kritik bir erken olaydıresponses. Bilinmeyen nedenlerden dolayı, ancak, inhale antijenleri elde tüm CDCS akciğere bırakmaz ve bu hücrelerin çoğunun, birkaç ay 5 için bu organda 6 kalır. Monosit türevli CD11c + kemokin reseptörü, CCR7 yoksun hücreler, bölgesel LN 7, 8 göç etmek mümkün olduğu için bu gözlem, bu hücrelerin gelişim kökenli ile açıklanabilir. CDCS göç potansiyeli de akciğer içindeki anatomik pozisyona göre, en azından kısmen, tespit edilir gibi görünmektedir. Bununla birlikte, akciğerdeki CDCS bu farklı popülasyonlarda kesin yeri tam olarak karakterize edilmemiştir. Akciğer içinde ve yöneltmek moleküllerin bağışıklık hücre lokalizasyonu iyileştirilmiş bir bilgi, akciğerin bağışıklık sistemi aktive olur nasıl daha iyi anlamak için gereklidir. PCLS olmak artıyorakciğer yapısının 9, 10 yapısal bütünlüğünü korurken, ly, hücresel konum ve hücre-hücre etkileşimleri görselleştirmek için bir eks vivo yaklaşımı olarak da kullanılır. PCLS fareler, sığır, maymun, koyun, at, ve insanlar 11 dahil olmak üzere birçok türün, akciğerlerini incelemek için kullanılmıştır. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yaklaşık 20 dilim böylece ayrı ayrı deneyler için gerekli hayvan sayısını azaltmak, bir fare akciğer Tek bir lobdan elde hazırlanabilir olmasıdır. DCler, makrofajlar, nötrofiller ve T hücreleri dahil olmak üzere hemen hemen tüm immün hücre tipleri, PCLS içinde mevcut olan ve normal yapısını korur. PCLS de asetilkolin 12 veya metakolin 13 ile tedaviden sonra, kalsiyum sinyal ve solunum yolu düz kas hücrelerinin kasılma incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşımda, akciğer sadece küçük bir kısmı, birmikroskobik alyzed ancak bir çalışma PCLS hava yolu daralması ölçümleri dilim dilim sadece yaklaşık% 10 farklılık gösterir ve bu varyans intakt hayvanlarda 14 akciğer fonksiyon testleri kullanılarak görülenle kıyaslanabilir olduğunu bildirdi. Diğer araştırmacılar, LPS 15 ile inkübe edildikten sonra, sitokin ekspresyon ve hücre yüzey markörlerinin değişiklikleri incelemek için bir eks vivo yaklaşımı olarak PCLS kullandık. PCLS aynı zamanda küçük içi asinar arterlerde pulmoner hipoksik vazokonstriksiyon bir ex vivo modelinde kullanılmıştır. Bu damarlar kesilmiş arter segmentler veya kalmanın damar 16 analizinden kayıtları gibi diğer prosedürler, ulaşılamıyor akciğer kısmında yer almaktadır. Bizim laboratuvar öncelikle bir in vivo ateşli güdünün ardından bağışıklık hücresi kalıcı halde canlı akciğer dokusunda lokalize edilmesini ve görselleştirmek için PCLS kullanmıştır. aşağıdaki gibi biz bunun için geliştirdik yöntemlerdir.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Prox1-TdTomato transgenic mice&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>018128</td><td>B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J</td></tr><tr><td>OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>004194, 016617</td><td>B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rag1 knock-out mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>002216</td><td>B6.129S7-Rag1&lt;sup&gt;tm1Mom&lt;/sup&gt;/J</td></tr><tr><td>Ovalbumin, Low Endo, Purified</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003059</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>427421</td><td>0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter</td></tr><tr><td>GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3112-125</td><td>2% solution dissolved in PBS at 70 &amp;deg;C and held at 40 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Compresstome VF-300</td><td>Precisionary Instruments, Inc.</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>Double Edge Stainless Razor Blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td>Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.</td></tr><tr><td>Krazy Glue All Purpose Instant Gel</td><td>VWR</td><td>500033-484</td><td>Commonly available for $3/tube in local drugstores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium, no phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Normal Rat Serum (NRS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>012-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Normal Mouse Serum (NMS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>015-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Staining Buffer</td><td>Made in House</td><td>N/A</td><td>PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)</td><td>Made in House</td><td>N/A</td><td>Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605</td><td>BioLegend</td><td>101237</td><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c Phycoerythrin</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td>PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c Allophycocyanin</td><td>BD Phamingen</td><td>550261</td><td>APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD88 Phycoerythrin</td><td>BioLegend</td><td>135806</td><td>PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD103 Allophycocyanin</td><td>eBioscience</td><td>17-1031-82</td><td>Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450</td><td>eBioscience</td><td>48-0902-82</td><td>Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin</td><td>eBioscience</td><td>17-1721-82</td><td>Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421</td><td>BD Horizon</td><td>564188</td><td>BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488</td><td>eBioscience</td><td>53-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647</td><td>eBioscience</td><td>51-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)</td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155411PK&amp;nbsp;</td><td>Pack of 16</td></tr><tr><td>15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness</td><td>MatTek Corperation</td><td>PCS-1.5-15</td><td></td></tr><tr><td>Bare Platinum Wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP201</td><td>0.020&quot; (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an &quot;L&quot; shape</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C, warm to room tempterature before use.</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td></td></tr></tbody></table>

precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells

alerjenler ve patojenlerin solunması akciğer immün hücre tiplerinde çeşitli birden çok değişiklik ortaya çıkarmaktadır. Akış sitometrisi bağışıklık hücreleri üzerinde hücre yüzey proteinlerinin kantitatif analizi için güçlü bir tekniktir, ancak bu akciğer içinde, bu hücrelerin lokalizasyonunda ve göç desen hakkında bilgi vermez. Benzer şekilde, kemotaksi deneyleri, in vitro olarak kemotaktik faktörlere yanıt hücrelerinin değişim potansiyelini araştırmak için yapılabilir, ancak bu deneyler, sağlam akciğer kompleks ortam yeniden yoktur. Bu yukarıda sözü edilen tekniklerin aksine, akciğer içinde tek tek hücre tiplerinde konumu hali hazırda ticari olarak temin edilebilir, flüoresan etiketli antikorlar ile boyanması, hassas-kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve konfokal mikroskopi ile bölümleri görselleştirme ile görselleştirilebilir. PCLS canlı her ikisi için kullanılan ve akciğer dokusunun sabit ve dilimler bütün bir lob kesiti kadar büyük alanları kapsayabilir edilebilir. Başarıyla dendritik hücrelerin farklı tipleri, makrofajlar, nötrofiller, T hücreleri ve B hücreleri gibi, örneğin lenfatik endotelyal gibi yapısal hücreleri dahil olmak üzere akciğerde hücre tipleri, çeşitli konumunu görselleştirmek için bu protokolü kullanılır, ve adres epitel hücreleri. Hücreler akciğer içinde hareket etmesi ve kararlı bir halde ve enflamasyon sırasında birbirleri ile nasıl etkileşime, canlı, üç boyutlu akciğer dokusunda dendritik hücreleri ve T hücreleri arasındaki gibi hücresel etkileşimler, görselleştirmek için yeteneği, ortaya çıkarabilir. gibi akış sitometrisi ve kantitatif PCR gibi başka prosedürler ile bir arada kullanıldığında Böylece, PCLS akciğerin allerjik ve enflamatuar hastalıkların altında yatan hücresel etkinlikleri kapsamlı bir anlayış katkıda bulunabilir.

C57BL / 6 farelerinden alınan iki DC alt-konumunu, CD11b hi CDCS ve CD103 + CDCS, PCLS belirlemek için kesilmiş ve CD11c özgü monoklonal antikor (mAb) ile boyanmıştır, CD88, CD103, CD324 ve (E-kadherin). CD324 leke hava yolu epitelial hücreler ile antikorlar ve CD88 makrofajlar ve nötrofiller, ancak CDCS 8 gösterilir. Bu, CD11c + makrofajlardan CDCS ayırt etmek ve hava yolları (Şekil 1), her hücre t?...

Watch this Scientific Journal Video about Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells at JoVE.com

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

precision-cut-mouse-lung-slices-to-visualize-live-pulmonary-dendritic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Görüntüleme.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH.  Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir. 

Video: Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Kanser Araştırmaları

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Tıp

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Biyoloji

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

İmünohistokimya ve Akım Sitometri Kullanımı Endobronşiyal Biyopsilerinde Mekansal Dağılımı ve Fenotipik Kimlik: İnsan Akciğer dendritik hücrelerin

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, the preservation of pulmonary vessels that truly represents physiological conditions still presents challenges. In addition, the delicate configuration of murine lungs result in technical challenges preparing samples for high-quality images that preserve both cellular composition and architecture. Similarly, cellular contractility assays can be performed to study the potential of cells to respond to vasoconstrictors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these technical issues, the precision-cut lung slice (PCLS) method can be applied as an efficient alternative to visualize lung tissue in three dimensions without regional bias and serve as a live surrogate contractility model for up to 10 days. Tissue prepared using PCLS has preserved structure and spatial orientation, making it ideal to study disease processes ex vivo. The location of endogenous tdTomato-labeled cells in PCLS harvested from an inducible tdTomato reporter murine model can be successfully visualized by confocal microscopy. After exposure to vasoconstrictors, PCLS demonstrates the preservation of both vessel contractility and lung structure, which can be captured by a time-lapse module. In combination with the other procedures, such as western blot and RNA analysis, PCLS can contribute to the comprehensive understanding of signaling cascades that underlie a wide variety of disorders and lead to a better understanding of the pathophysiology in pulmonary vascular diseases.

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Presented here is a protocol for preserving the vascular contractility of PCLS murine lung tissue, resulting in a sophisticated three-dimensional image of the pulmonary vasculature and airway, which can be preserved for up to 10 days that is susceptible to numerous procedures.

Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Agaroz gömülü vibratom bölümleri kullanılarak yenilikçi akciğer görüntüleme

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

Yazar Spotlight: Agaroz Gömülü Akciğer Dokusu Bölümlerini Kullanarak Uzamsal Protein Ekspresyonunun İncelenmesi 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

Multipleks Floresan Görüntüleme için Agaroz Gömülü Akciğer Dokusunun Otomatik Vibratom Kesiti

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize'a Fare Akciğer Dilimleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

İmünohistokimya ve Akım Sitometri Kullanımı Endobronşiyal Biyopsilerinde Mekansal Dağılımı ve Fenotipik Kimlik: İnsan Akciğer dendritik hücrelerin

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

Multipleks Floresan Görüntüleme için Agaroz Gömülü Akciğer Dokusunun Otomatik Vibratom Kesiti

Multipleks Floresan Görüntüleme için Agaroz Gömülü Akciğer Dokusunun Otomatik Vibratom Kesiti