يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتوليد مكتبات الحمض النووي الريبي كاملة الطول المطفرة عشوائيا من الجينومات الفيروسية للحمض النووي الريبي الإيجابي أحادي الشريط يصل طولها إلى 10 كيلوبايت ، واختيار الأنماط الظاهرية ذات الأهمية في ظل الظروف التجريبية المرغوبة. يمكن لهذه التقنية إنشاء مكتبات RNA فيروسية كاملة الطول بمستويات متفاوتة من التنوع الجيني في وقت قصير باستخدام نهج خال من الاستنساخ. تستخدم هذه التقنية كواشف غير مكلفة ومتاحة على نطاق واسع لتوليف المكتبات.
سيوضح الإجراء شاهين خان ، طالب الدكتوراه من قسم علم الفيروسات ، قسم علوم الحياة ، جامعة شيف نادار. للبدء ، قم بإجراء ep-PCR عن طريق تحضير المزيج الرئيسي لأربع مجموعات من التجارب مع الاشعال الأمامية والخلفية جنبا إلى جنب مع مكونات التفاعل بدون قالب pJFH1 ، كما هو موضح في مخطوطة النص. Aliquot مزيج سيد في أربعة أنابيب.
أضف 100 نانوجرام، و50 نانوجرام، و25 نانوجرام، و10 نانوجرامات من القالب إلى الأنابيب المنفردة، واضبط الحجم الكلي للتفاعل إلى 50 ميكرولتر. قم بتطبيق شروط ركوب الدراجات لتضخيم جزء زوج 97 36 قاعدة. قم بتقدير منتج ep-PCR الذي تم تضخيمه عن طريق تحميل خمسة ميكرولترات من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ومقارنته بكميات معروفة من سلم الحمض النووي ذي الكيلو قاعدة واحدة عن طريق تشغيل رحلان كهربائي لهلام الأغاروز القائم على 0.8٪ TAE.
قم بتنقية المنتج باستخدام مجموعة تنقية الأعمدة. تقدير تركيز المنتج المنقى عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر. قم بتركيز منتج ep-PCR بالفراغ للحصول على تركيز منتج يساوي أو يزيد عن 100 نانوجرام لكل ميكرولتر.
قم بإعداد تفاعل تخليق الحمض النووي الريبي في المختبر ، وضعه عند 37 درجة مئوية للحضانة. ثم قم بتنقية المنتج المركب باستخدام مجموعة تنقية العمود. قم بإعداد تفاعل تخليق cDNA 20 ميكرولتر عن طريق إضافة ما يقرب من ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي الفيروسي ، وخمسة ميكرومولار التمهيدي العكسي ، و 200 وحدة من النسخ العكسي ، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
باستخدام cDNA ، قم بإعداد خليط تفاعل كما هو موضح في مخطوطة النص ، وقم بتشغيل دورة تضخيم. قم بتشغيل المنتج على جل أغاروز قائم على 0.8٪ TAE لتأكيد حجم المنتج البالغ 25 زوجا من 71 قاعدة ، ثم قم بتنقية المنتج باستخدام مجموعة تنقية العمود كما هو موضح سابقا. Elute في 40 ميكرولتر من الماء المعقم.
لإضافة ثلاثة أجزاء أولية A متدلية ، أضف 0.5 ميكرومولار DATP ووحدة واحدة من بوليميراز Taq DNA منخفض الدقة ، واحتضان منتج PCR بالكامل عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، جنبا إلى جنب مع 1X PCR buffer و 1.5 مليمولار كلوريد المغنيسيوم. ثم قم بتنقية الخليط باستخدام مجموعة تنقية العمود. قم بإعداد تفاعل الربط ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات.
ثم أضف 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية DH5-Alpha إلى الحمض النووي المرتبط ، وقم بصدمة حرارية للخلايا عند 42 درجة مئوية لمدة 35 ثانية. أضف ملليلترا واحدا من وسط LB إلى تعليق الخلية ، واحتضانه مع رج لطيف لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 13،800 RCF.
تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من وسط LB الطازج. صفيحة 100 ميكرولتر من خلايا E.coli DH5-Alpha المحولة على صفيحة LB تحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسلين ، وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. قم بإعداد تحضيرات صغيرة من 25 إلى 30 مستعمرة في خمسة ملليلتر من وسط LB يحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسلين ، وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، استخرج البلازميدات بمجموعة تجارية وقم بإجراء هضم إنزيم التقييد بحجم 10 ميكرولتر مع 200 نانوجرام من البلازميدات المعزولة ، ووحدتين من EcoR1 و 1X تقييد عازلة لجميع المستعمرات. بعد احتضان مخاليط الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ، قم بتحميل المنتجات على جل الأغاروز القائم على 0.8٪ TAE لتأكيد إدخال الحمض النووي البلازميد. أداء تسلسل سانجر من البلازميدات من 25 استنساخ إيجابي باستخدام الاشعال الموصى بها.
قبل يوم واحد من النقل ، قم بتقسيم الخلايا ، واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم. ثم زرع الورم الكبدي البشري 7.5 خلايا في أطباق 35 ملم في ملليلتر من DMEM الكامل ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في حاضنة مرطبة مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإعداد مجمع الدهون النصي عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من كاشف النقل في 50 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي ، وتخفيف خمسة ميكروغرام من النسخ الفيروسية بشكل منفصل في 50 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي.
احتضان كلا الخليطين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم امزجها في أنبوب طرد مركزي معقم واحد ، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد حضانة الخلية ، قم بإزالة وسط الثقافة ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1X PBS المسخن مسبقا ، وأضف 1.5 ملليلتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي.
أضف المجمع ببطء ، وقم بتدوير الطبق برفق لتوزيع موحد. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 ساعات. ثم قم بإزالة الوسيط.
اغسل الخلايا المنقولة مرتين باستخدام 1X PBS واحد ملليلتر تم تسخينه مسبقا ، وأضف ملليلتر من DMEM الكامل. اعزل الحمض النووي الريبي الفيروسي من 140 ميكرولترا من طافات الثقافة باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي. قم بإعداد تفاعل qRT-PCR سعة 10 ميكرولتر باستخدام مجموعة qRT-PCR التجارية.
استخدم البادئات الأمامية والخلفية والمسبار لقياس الحمض النووي الريبي HCV. اضبط دورة التفاعل على 48 درجة سلزية لمدة 20 دقيقة، و95 درجة سلزية لمدة 10 دقائق، و45 دورة من 95 درجة سلزية لمدة 15 ثانية، و60 درجة سلزية لمدة دقيقة واحدة. قم بتشغيل ردود الفعل ، وقم بإعداد عناصر تحكم سلبية.
في موازاة ذلك ، قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام عدد نسخ معروف مخفف بشكل متسلسل من نسخ HCV لتحديد كمية الحمض النووي الريبي الفيروسي. أداء في ثلاث نسخ. صفيحة الورم الكبدي البشري 7.5 خلايا في صفيحة 96 بئرا ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ قبل حوالي 16 ساعة من إضافة الفيروس.
في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، قم بإجراء عشرة أضعاف التخفيفات التسلسلية للفيروس. أضف 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف لكل بئر لإصابة الخلايا ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاثة أيام ، اغسل الخلايا المصابة ثلاث مرات ب 0.1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ، وقم بإصلاح الخلايا واختراقها ب 0.1 ملليلتر من الميثانول البارد المثلج عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة.
اغسل الآبار باستخدام 1X PBS ثلاث مرات ، ثم 1X باستخدام PBST. بعد إزالة PBST ، قم بسد الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام 0.1 ملليلتر من 1٪ BSA تحتوي على 0.2٪ حليب منزوع الدسم في PBST. قم بإزالة محلول الحجب ، وعالج الخلايا لمدة خمس دقائق باستخدام 0.1 ملليلتر من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ المحضر في 1X PBS.
مرة أخرى ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1X PBS ، و 1X باستخدام PBST. أضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل NS5A 9E10 لكل بئر ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1X PBS ومرة واحدة باستخدام PBST.
أضف 50 ميكرولترا من IgG الثانوي المضاد للفأر HRP لكل بئر ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة الجسم المضاد غير المنضم عن طريق غسل الآبار ب 0.1 ملليلتر من 1X PBS. أضف 30 ميكرولترا من DAB ، واحتضن اللوحة بهزاز لطيف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول DAB ، واغسل الآبار مرتين باستخدام 1X PBS ، ومرة واحدة بالماء المقطر.
أضف 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.03٪ أزيد الصوديوم. افحص كل بئر تحت مجهر ضوئي مقلوب باستخدام هدف 10X. احسب عدد الآبار الإيجابية.
استخدم حاسبة Reed and Muench لتقدير تخفيف نقطة النهاية الذي يصيب 50٪ من الآبار. قم بإذابة pibrentasvir ، وهو مثبط NS5A ، في 100٪ DMSO إلى تركيز مليمولار واحد وقم بتخفيفه في DMEM الكامل إلى تركيز 10 نانومولار. ثم تصيب خلايا Huh-7.5 الساذجة عند التقاء 70٪ بجرعة فيروس ML50 لإصابة 50٪ من الخلايا لمدة 12 ساعة ، ثم نقل الخلايا المصابة إلى ست لوحات جيدة بعد 24 ساعة من الإصابة.
أضف 1X EC50 PIB إلى الخلايا المصابة بعد 16 ساعة من انقسام الخلايا. افعل ذلك بعد انقسام كل خلية لمدة ستة مقاطع متتالية ، تليها ثلاث دورات مرور خالية من المخدرات ، ومراقبة انتشار الفيروس باستخدام مقايسة تشكيل التركيز. احصد الطافات الفيروسية في كل ممر ، واحفظها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من طاف في اليوم 18 و cDNA توليفها. تضخيم جين NS5A باستخدام خمسة ميكرولترات من الحمض النووي المخفف. ثم حدد طفرات مقاومة الأدوية NS5A في ستة إلى ثمانية بلازميدات بكتيرية إيجابية باستخدام بادئات تسلسل NS5A.
تم تصنيع مكتبات الجينوم الطافرة الكاملة باستخدام pJFH1 النسيلي بكميات متناقصة من 100 إلى 10 نانوجرام. تراوح متوسط غلة منتجات ep-PCR من 3.8 إلى 12.5 نانوجرام لكل ميكرولتر. زادت نسبة الطفرات في المكتبات الطافرة مع انخفاض مدخلات pJFH1 في تفاعل ep-PCR.
تم تصنيع ML50 باستخدام 50 نانوجرام من القالب وكان له أربعة بدائل لكل 10،000 زوج أساسي منسوخ ، في حين أن ML25 المركب باستخدام 25 نانوجرام من القالب يحتوي على تسعة بدائل. لم يتم العثور على بدائل ضمن عدد النيوكليوتيدات المتسلسلة في pJFH1 النسيلي. كانت المتغيرات الفيروسية ML50 أقل عرضة لبيبرينتاسفير مقارنة بفيروس JFH1 النسيلي.
من بين استنساخ NS5A الثمانية ، كان لدى أربعة مزيج من D7V + F28C ، بينما حدث V8A + F28C و F36L في نسخة واحدة لكل منهما. كانت هذه الطفرات في منطقة المحطة N من NS5A ، والتي من المعروف أنها تؤوي طفرات مقاومة NS5A ذات الصلة سريريا. يعد التركيز النهائي لكل مكون من مكونات ep-PCR أمرا بالغ الأهمية ، خاصة كمية القالب.
سيؤدي عدم وجود موسع KB إلى تقليل إنتاجية منتج ep-PCR بشكل كبير.
