Farklı enerji substratlarının kullanımı hem hücre tipine özgü hem de hastalığın göstergesidir. Spesifik substratların tüketiminin ölçülmesi hem normal biyolojiye hem de patolojiye ışık tutabilir. Teknik özel ekipmana ihtiyaç duymaz ve ölçeklendirilmesi kolaydır.
Kullanımı daha önce yayınlanmış yöntemlerden daha kolaydır. Substrat oksidasyon hızındaki değişikliklerin anlaşılması, metabolik bozukluklar için diyet ve farmakolojik müdahalelerin geliştirilmesine izin verecektir. Kemik dokusu ile gösterilmesine rağmen, bu teknik, metabolik kaymaların hem nedenlerini hem de sonuçlarını anlamayı sağlayan tüm hücre tiplerinde metabolik esnekliği incelemek için kolayca özelleştirilebilir.
Doğum sonrası üç ila beş günün yavrularını feda ettikten sonra, onları penisilin streptomisin çift antibiyotik çözeltisi içeren buz gibi soğuk D PBS'ye aktarın. Cildi ve yumuşak dokuyu çıkararak kalvariyi açığa çıkarın. D PBS'de çevredeki dokuları arkadan öne doğru keserek orta bölgeyi toplayın.
Kalvarinin iç ve dış yüzeylerini, sonraki sindirimde hücrelerin serbest bırakılmasına yardımcı olmak için cımbız kullanarak hafifçe çizin. D PBS'de mililitre başına 2 ve 4 miligram kollajenaz tip iki çözelti hazırlayın ve her çözeltiyi taze bir 0.22 mikrometre filtre ile filtreleyin. İlk önce, temizlenmiş kalvariyi mililitre kollajenaz çözeltisi başına iki miligram ile 15 dakika boyunca sindirin ve ardından sindirim çözeltisini atın.
Daha sonra, temiz numuneleri mililitre kollajenaz çözeltisi başına dört miligramda her seferinde 15 dakika boyunca üç kez sindirin. Ardından, sindirim solüsyonunu çekin ve kaydedin. Sindirim solüsyonunu 70 mikrometre hücre süzgecinden süzün ve filtratın 300 RCF'de beş dakika boyunca santrifüj edilmesini sağlayın.
Hücre peletini% 10 FBS ve penisilin streptomisin ikili antibiyotik çözeltisi içeren tam MEM alfa ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri 10 santimetrelik bir plakada sayın ve tohumlayın. Hücreleri üç gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecelik bir inkübatörde kültürleyin.
Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede 0.25 Tripsin EDTA ile ayırın. Sindirimden sonra, hücreleri% 10 FBS ve penisilin streptomisin çift antibiyotik çözeltisi içeren tam bir MEM alfa ortamı ile 24 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında sayın ve tohumlayın. Substrat başına hücre tipi başına en az dört kuyucuk ve ön tahlil sayımı için her hücre tipi için en az üç ekstra kuyucuk tohumlayın.
Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede kültürleyin. Kas ve bağ dokusunu sekiz haftalık farelerden çıkardıktan ve femurları ve tibiasları topladıktan sonra, kemiklerin her iki ucunu keskin makasla kesin ve atın. Kemik iliğini bir femur ve bir tibiadan,% 10 FBS penisilin streptomisin çift antibiyotik çözeltisi ve% 10 CGM 14 12 şartlandırılmış ortam ile 15 mililitre tam MEM alfa ortamı içeren 23 gauge iğne içeren bir şırınga ile donatılmış bir şırınga ile taze bir 10 santimetrelik Petri kabına yıkayın.
Petri kabındaki hücreleri% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde kültürleyin. Üç gün sonra kültür ortamını atın ve hücreleri D PBS ile durulayın. Bağlı hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca% 0.25 Tripsin EDTA ile ayırın.
Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini BMM ortamında yeniden askıya alın. Daha önce açıklanan prosedür başına hücreleri 24 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında sayın ve tohumlayın. Tahlillere başlamadan önce BMM ortamında gece boyunca 37 santigrat derecede kültür.
Ekstra kuyucuklardaki hücreleri D PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri% 0.25 Tripsin EDTA ile ayırın. D PBS'de 20 mikrolitre sindirilmiş hücreyi askıya alın.
20 mikrolitre akridin portakal ve propidiyum iyodür boya çözeltisi ile, otomatik bir hücre sayacı ile canlı hücre sayısını belirleyin ve sayıyı kaydedin. Tahlil kuyucuklarındaki hücreleri D PBS ile iki kez yıkayın. RAM olarak belirlenmiş doku kültürü başlığındaki her tahlil kuyusuna 500 mikrolitre sıcak ortam ekleyin.
Plakayı parafilm ile kapattıktan sonra, hücreleri 4 saat boyunca 37 santigrat derecede RAM olarak belirlenmiş bir inkübatörde inkübe edin. Kuluçka sırasında, filtre kağıdını 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünün kapağının içindeki alandan biraz daha büyük dairesel parçalar halinde kesin ve kağıdı kapağa sıkıca yerleştirin. Her tüpe 200 mikrolitre bir 1 molar Perklorik asit ve kapağın içine yerleştirilmiş filtre kağıdına 20 mikrolitre sodyum hidroksit ekleyin.
Hücreleri inkübe ettikten sonra, her bir kuyucuktan hazırlanan tüplere 400 mikrolitre kültür ortamı aktarın ve kapakları hemen kapatın. Tüpleri bir saat boyunca oda sıcaklığında bir tüp rafında bırakın. , inkübasyon sırasında her tüp için bir parıltı şişesi kurar ve dört mililitre parıltı sıvısı ile doldurur.
Her bir filtre kağıdı parçasını bir parıltı şişesine aktarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Doku kültürü davlumbazında, su banyosunda, buzdolabında, inkübatörde, lavaboda, zeminde ve diğer çalışma alanlarında potansiyel RAM kontaminasyonu için silme testleri yapın. Kağıt mendilleri parıltı sıvısı içeren parıltı şişelerine koyun.
Parıltı şişelerindeki karbon 14 radyo aktivitesini bir parıltı sayacı ile ölçün ve okuma sonuçlarını kaydedin. Gerekirse, radyasyon güvenliği kurallarına göre çalışma ortamını dekontamine edin. Şekil, substrat oksidasyonunu primer kalvari pre osteoblastlara karşı BMM'lere göre karşılaştırmaktadır.
Birincil hücreler bir gecede tam MEM alfa ortamında geçirildikten ve kültürlendikten sonra, tipik olarak% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşırlar ve karakteristik morfolojilerini sergilerler. Kalvarial pre osteoblastlar BMM'lerden önemli ölçüde daha büyüktür. Substrat oksidasyonunun sonuçları, her substrat için oksidasyon hızının, kalvarial pre osteoblastlarda BMM'lerden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ve muhtemelen pre osteoblastlarda oksidatif fosforilasyon ile daha yüksek enerji üretimine işaret ettiğini göstermiştir.
Eklenen üçüncü kağıt, 1,7 mililitrelik ebin üst tüp kapağından biraz daha büyük olmalıdır. Bu yöntem, oksijen tüketimi ile birlikte ve hücrelerdeki oksidatif fosforilasyon ve laktatif üretimin genel oranını belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, farklı farklılaşma aşamalarında veya hastalık ortamlarında substrat kullanımını belirlemek için kullanılabilir.
Bu bilgi ile metabolik bozukluklar için müdahaleler geliştirebiliriz.
