The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Pe&#241;a for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.

Tüm hayvan deneyleri NIAID Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı LIG-4 hayvan protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Reaktiflerin 1. Hazırlık <ol><li> Manyetik ayırma (MS) tamponu hazırlayın:% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ve% 0.5 BSA ile takviye edilmiş, otomatik ayırma çözeltisi ile takviye edilmiş PBS (pH 7.2). 2-8 ° C&#39;de steril filtre (0.22 um) ve mağaza. </li><li> RF10 orta hazırlayın: RPMI 1640 ortam,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu, 50 U / ml penisilin, 50 uM streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM temel olmayan amino asitler ile takviye edilmiş 50 uM 2 p-merkaptoetanol, 10 mM HEPES. Steril reaktif kullanın. 2-8 ° C&#39;de steril filtre ve mağaza. </li><li> 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin ve 25 mM glukoz ile desteklenmiş XF taban ortamı: mitokondriyal stres testi hazırlarlar. </li><li> glikoliz stres testi ortamı hazırlayın: XF taban orta supplemen2 mM L-glutamin ile ted. </li><li> 2-8 ° C&#39;de 7.4, steril filtre ve mağaza için mitokondriyal ve glikoliz stres testi medya hem de pH ayarlayın. kullanım (37 ° C&#39;de pH ölçümleri yürütmek) önce 37 ° C ve sıcak ortam pH&#39;ı yeniden ayarlayın. Not: XF ortamının kullanılması, bikarbonat yoksun önemlidir. Hücre dışı akı analizörü atmosfer sadece ortam CO 2 içerdiğinden, orta herhangi bikarbonat, glikoliz bir yan ürünü olarak piyasaya proton bağlanması üzerine CO 2 ve su oluşturur ayırmak olacaktır. CO 2 olacak glikolitik asitlenme sinyalini belirsiz olacağını pH sürükleniyor neden deney sırasında gazdan arındırın. </li><li> oligomycin hazırlayın: 10 mm DMSO stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 2,4-DNP hazırlayın: DMSO 1 M stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> antimisin hazırlayın: 10 mm DMSO stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> rotenone hazırlayın: 10 mM s hazırlayınDMSO içinde tak solüsyonu; -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> glikoz hazırlayın: 250 mM çözelti oluşturmak üzere glikoliz stres testi ortamında glukozu eritin; Her deneyden önce taze hazırlamak ve donma yok. </li><li> 2-DG hazırlayın: 500 mM çözelti oluşturmak üzere glikoliz stres test ortamında 2-DG katı eritin; Her deneyden önce taze hazırlamak ve donma yok. </li></ol> 2. fareler ile Hasat dalak ve lenf düğümlerinde <ol><li> Servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 boğulma fare Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile fare püskürtün. </li><li> sonraki T hücre izolasyonu için, dalak, yüzeysel servikal, yüzeysel / derin aksiller, çene, kasık ve mezenterik lenf düğümleri hasat. </li><li> sonraki B hücre izolasyonu için, hasat sadece dalak. NOT: Bir biyogüvenlik kabini kullanın ve işleme kadar buz üzerinde PBS veya RF10 medyada hasat organları tutmak. tüm işlem ve isol için steril laboratuar aletlerinin ve steril tekniği kullanıntirme adımlar. izolasyon verimliliğini artırmak ve hücre ölümünü azaltmak için buz üzerinde tüm tamponları ve medya tutun. </li></ol> 3. Doku İşleme <ol><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp üzerinde 70 mikron hücre süzgeç yerleştirin ve süzgeç üzerine organları aktarın. T hücre izolasyonu için, tüm organları birleştirmek ve B hücre izolasyonu transferi sadece dalak için. </li><li> steril 3 ml şırınga pistonu kullanarak, süzgecinden doku ezin. ezme esnasında, filtre ve organlar her zaman nemli olduğundan emin olun ve MS tampon ekleyerek gerektirdiği gibi onları ıslatın. Bu, hem yüksek hücre viyabilitesini tutmak ve filtrenin tıkanmasını engeller. </li><li> ezme sonra, 5-10 uygulamak ml MS hücre kurtarma artırmak için filtreye tampon. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. (Belirtilmedikçe, bu koşullar altında diğer tüm santrüfüj yürütmek). </li><li> Sıvı süzün ve 5 mi ACK alyuvar lisiz tamponu içinde tekrar süspansiyon pelet. incuBuz üzerinde 5 dakika boyunca kesmek (bunlar manyetik ayırma ile müdahale için kırmızı kan hücreleri kaldırılması gerekir), kırmızı kan hücreleri lize etmek için. 10-20 ekle ml MS tampon ve santrifüj. </li><li> 1 ml MS tamponu (eritrosit lizis enkaz kaldırmak bu filtrasyon) ile 15 ml konik tüp üzerinde 30 mikron hücre filtresi yerleştirin ve prime. santrifüj tüpten çıkan sıvı tortusundan ayırma, tampon ve filtre içinden geçmek 5 mi MS pelet tekrar süspansiyon. Hücre kurtarma artırmak ve filtreyi durulayın bu kullanmak için 4 ml MS tamponu ile ilk tüp yıkayın. </li><li> Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı, hücrelerin toplam sayısını belirler. Bu hücre sayısı, splenositler daha sonra hücre dışı akı deneyinde kullanılacak ise, Bölüm 4&#39;te gerekli manyetik ayırma reaktifleri miktarının belirlenmesi için kullanılan bu zamanda hücrelerin uygun sayıda kenara olacaktır. </li><li> süspansiyon Santrifüj ve manyetik ayırma geçin. Süspanse Splenositler kullanılmazve 5 ml RF10 B hücre izolasyonu için hücre dışı akı analize kadar buz üzerinde tutmak. </li></ol> B hücreleri ve naif CD4 + T hücrelerinin 4. Manyetik Ayırma <ol><li> biyotin-antikor kokteyli, anti-biyotin mikro-ve MS tampon gerekli hacimleri belirler. Bir kılavuz olarak 10 8 hücreleri için aşağıdaki miktarlar kullanın ve büyütmek ya da gerektiğinde aşağı. Not: bir buzdolabında çok buz üzerinde daha antikor bağlanma etkinliği ve daha uzun inkübasyon süreleri gerekli olabilir azaltabilir buz üzerinde inkübe yana örnekleri inkübe edin. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Naif CD4 + T hücre ayrılması için reaktifler </td><td> 10 8 hücreleri için hacim </td></tr><tr><td> (uygun ölçek) </td></tr><tr><td> Biotin-antikor kokteyli </td><td> 100 ul</td></tr><tr><td> birinci kuluçkalamada MS tamponu </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Anti-biyotin mikro- </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> CD44 mikroboncuklarının </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> ikinci inkübasyon için MS tampon </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> 5 dakika boyunca 4 ° C &#39;de, biyotin-antikor kokteyli ve hücreler inkübe edin. anti-biyotin mikroboncukları, CD44 mikroboncukları ekleme MS tamponu ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: T hücre izolasyonu hacimleri ve talimatlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> B hücre ayrılması için reaktifler </td><td> 10 8 hücreleri için hacim </td></tr><tr><td> (uygun ölçek) </td></tr><tr><td> Biotin-antikor kokteyli </td&gt; <td> 100 ul </td></tr><tr><td> birinci kuluçkalamada MS tamponu </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Anti-biyotin mikro- </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> ikinci inkübasyon için MS tampon </td><td> 300 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de, biyotin-antikor kokteyli ve hücreler inkübe edin. biyotin-antikor kokteyli ve MS tamponu uygun hacimde ekleyin ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de karışım inkübe edin. anti-biyotin mikroboncuk uygun hacimde ilave edin ve MS tamponu ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de karışım inkübe edin. ikinci bir inkübasyondan sonra, MS tamponu ve santrifüj ile tüp doldurun. </td></tr></tbody></table> Tablo 2: B hücre izolasyon hacimleri ve talimatlar. <ol start="2"><li> MS tamponu pelletini: el ayrılması için 500 ul, otomatik ayırma 3-4 ml. </li><li> manuel veya otomatik ayrımları ya devamaşağıdaki gibi: <ol><li> Manuel Ayırma: <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3 mi MS tamponu ile yıkanarak akışı ve asal kolon toplamak için aşağıdaki steril bir 15 ml konik bir tüp yerleştirmek ayırma mıknatıs bir LS sütun ekle. akış atmak. </li><li> astarlanmış LS sütun hücre süspansiyonu aktarın ve geçmesine izin; MS tampon ve aynı zamanda sütun üzerinden bu geçiş 3 ml inkübasyon sırasında kullanılan tüp yıkayın. Eluat saflaştırılmış hücreleri içerir. B hücre izolasyonu için, yeni bir 15 ml tüp içine sütunu içinden ikinci kez saflaştırılmış hücreleri geçer ve yıkama adımı tekrar edin. Bu saflık ve verim artacaktır. </li></ol></li><li> Otomatik Ayırma: <ol><li> Otomatik separatör açın ve tampon çalışan solüsyonu ve% 70 Etanol durulama düzeylerini kontrol edin. Atık ayırma başlamadan önce boş olduğundan emin olun. </li><li> t tüp boyutuna bağlı olarak uygun soğutulmuş raf seçinO saflaştırılmamış örneği (örneğin, 15 mi). ayırma süreci boyunca canlı hücreleri tutmak için, daha önce 3-4 saat boyunca 2-8 ° C&#39;de soğutulmuş olan rafları kullanın veya kadar soğutucu katı hale gelir. </li><li> Otomatik ayırıcı örnek sahnede soğutulmuş raf monte edin. </li><li> yuva A1, yuva B1 olumsuz kısmı için bir tüp içinde örnek tüp, ve C1 pozitif kısmı için bir tüp yerleştirin. Birden fazla numune toplama, bir sonraki sütunlara (A2, B2, C2, vb) ilave tüpleri. </li><li> dokunmatik ekranda ayırma sekmesini seçin ve raf tüplerin düzenlemeyi göstermektedir. ayırma menüsünden, &quot;tüketir&quot; programı seçin ve yıkama uygun tip programı döngüsünü tamamlamak (aşağıdaki nota bakınız). NOT: &quot;tüketir&quot; programı saflığı ön planda makinenin en hassas modunu kullanarak tükenmesi yürütmektedir. Buna ek olarak, üç farklı yıkama seçeneği vardır: quic, Durulama durulayın ve uyku k. Numuneler aynı kaynaktan gelen ve kombine edilecekse, hızlı durulama seçin. Numuneler ayrı tutulması ise, durulama seçin. başka izolasyonlar o gün yapılacaktır eğer uyku seçeneği seçin ve makine izolasyonu aşağıdaki kapatılacak eğer </li><li> &quot;Çalıştır&quot; tuşuna basarak izolasyon başlatın ve istendiğinde tampon seviyelerini onaylayın. Program sona erdikten sonra, negatif fraksiyon saflaştırılmış hücreler içerir. </li></ol></li><li> MS tampon ve santrifüj ile 15 ml konik tüp kadar doldurun. </li><li> MS tampon ve tekrar süspansiyon hücreleri 5 ml RF10 medyada süzün. Hücre dışı akı analize kadar buz üzerinde hücreleri tutun. NOT: İdeal olarak, hücre dışı akı tahlil izolasyon hemen sonra yapılmalıdır. Ancak, ön deneylerde deney sonuçlarında önemli bir fark taze olarak yalıtılmış olanlar karşı tecrit 3 saat içinde kullanılan hücrelerde gözlendi. </li></ol></li></ol> Not: burada açıklanan protokol aracının 96 oyuklu bir formatta içindir. Başka bir biçim kullanılırsa Ciltler ayarlanması gerekir. <ol><li> Sensör Kartuşu hidrasyon <ol><li> kalibrant çözeltide sensörleri daldırarak, sensör kartuşunu yukarı kaldırın kalibrant çözeltisi 200 ul yarar plakanın Her çukurun dolgu ve yardımcı plaka üzerine sensör kartuşu indirin. NOT: kalibrant çözüm seviyesi batık sensörleri tutmak için yeterince yüksek olduğundan emin olun. Kartuş her bir kuyu için O 2 ve H + ilişkili florofor limanlar; bunları düzgün çalışması için, bu sırayla hidre edilmesi gerekir. </li><li> Olup CO2 veya oksijen / azot ile desteklenmiş 37 ° C kuluçka makinesi içinde kartuşu yerleştirin. belirtilmediği sürece, bu koşullar altında diğer tüm inkubasyon yürütmek. nemlendirmek için gece kartuşu inkübe edin. </li></ol></li><li> preparYapışkan kaplı plakalar arasında ation <ol><li> 0.1 M sodyum bikarbonat içinde 22.4 ug / ml yapışkan çözeltinin 2.5 mi hazırlanması, pH 8.0 (bikarbonat yapıştırıcı adsorpsiyonu için uygun pH sağlar). </li><li> deney plakasının her oyuğuna çözeltisi 25 ul uygulanır ve 20 dakika için oda sıcaklığında tezgah üzerinde inkübe edin. </li><li> Aspire yapıştırıcı ve her bir yıkama iki steril su, 200 ul kullanılmıştır. kuyular hücrelerin ekim önce kuruyana kadar bekleyin. </li></ol></li><li> Yapışkan kaplı plakalar hücreleri tohumlama <ol><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de oda sıcaklığında santrifüje hücreleri. Uygun tahlil ortamı, 5 ml içinde süspanse hücreleri (mitokondriyal stresi ve glukoz gerilme ortam formülasyonu için yukarıya bakınız). deney ortamı istenen konsantrasyonda Santrifüj tekrar hücreleri ve tekrar süspansiyon (tabanda hacmi konsantrasyonuna göre değişir, her kuyu hücre süspansiyonu 180 ul içerecektir). NOT: Uygun tahlil medya ve bileşik süreces dışı akı analizörü aynı anda aynı plaka üzerinde mitokondriyal ve glikoliz stres testleri çalıştırabilirsiniz kullanılmaktadır. </li><li> her bir hücre süspansiyonu 180 ul Plate. arkaplan sıcaklık düzeltmesi için kuyu A1, A12, H1 ve H12 kullanın: bu kuyulardan (hiçbir hücreleri) deney ortamı 180 ul ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 25 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Tüm hücreler tam takılı olmasını sağlamak için hiçbir fren ile 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de plaka santrifüj. Görme hücreleri stabil mikroskop altında görüntüleyerek, bir tek tabaka oluşturan, kültür yüzeye yapışık olduğunu doğrulamaktadır. ilave bir 30 dakika boyunca geri plakaları aktarın. </li></ol></li><li> Bileşiklerin 10x Konsantrasyonlarına hazırlanması ve Enjektör Limanlar Yükleme <ol><li> mitokondriyal stres testi için, 10 uM oligomycin, 1mM DNP ve mitokondriyal stresi deney Mediu&#39;nun 10 uM rotenone ve 10 uM antimisin, her bir karışımının her bir 2.5 mL hazırlanmasım. Not: 2,4-DNP konsantrasyonu, daha önce yayınlanan çalışmalara dayanmaktadır; 21, bu genel bir kural olarak, ancak bir araştırmacı tarafından belirlenmelidir kullanılan her hücre tipi için uncoupler konsantrasyonudur. </li><li> glikoliz stres testi için, 2.5 mi, 250 mM glukoz, 10 uM oligomycin ve glikoliz gerilme deney ortamı içinde 500 mM 2-deoksiglukoz (2-DG) her hazırlanması. </li><li> Sıcak 10x 37 ° C solüsyon ve pH 7.4 ayarlanır. </li><li> aşağıdaki gibi bir çok kanallı micropipettor ve yükleme kılavuzları kullanarak kartuşun uygun enjektör portlarına bileşikleri yükleyin: <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Liman </td><td> Mitokondriyal Stres Testi </td><td> Glikoliz Stres Testi </td></tr><tr><td> bir </td><td> 20 ul oligomycin </td><td> 20 ul glukoz </td></tr><tr><td> B </td><td> 22 ul 2,4-DNP </td><td> 22 ul oligomycin </td></tr><tr><td> C </td><td> 25 ul antimisin / rotenon </td><td> 25 p, l 2-DG </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Bileşik hacimleri. NOT: portların Her dizi (örneğin, tüm bağlantı noktaları A) aynı ses içermelidir. (Kullanılmayan kuyularda port deney ortamı ile aynı hacmi ile yüklenebilir) olarak bileşimleri enjekte edilmez, belirli bir seriye ait tüm kaynaklar, daha deneyde kullanılan olmayanlar yüklü çok önemlidir. </li><li> Programı kurarken kartuşu kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol></li><li> Ekstraselüler Akı Deneyi Protokolleri Kurma <ol><li> Aşağıdaki programı (Tablo 4) ayarlayın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Adım </td><td> döngü </td></tr&gt; <tr><td> ayarlama </td><td> - </td></tr><tr><td> Dengeleme </td><td> - </td></tr><tr><td> Baseline okumalar </td><td> 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin </td></tr><tr><td> bitiş döngü </td><td> - </td></tr><tr><td> Liman A enjekte </td><td> - </td></tr><tr><td> ölçümler </td><td> 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin </td></tr><tr><td> bitiş döngü </td><td> - </td></tr><tr><td> Liman B enjekte </td><td> - </td></tr><tr><td> ölçümler </td><td> 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin </td></tr><tr><td> bitiş döngü </td><td> - </td></tr><tr><td> Liman C enjekte </td><td> - </td></tr><tr><td> ölçümler </td><td> 3 kez: MEASUR, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyinE 3 dakika </td></tr><tr><td> bitiş döngü </td><td> - </td></tr><tr><td> bitiş Programı </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Program düzeni. Not: aktif hücreleri kullanıldığında, belirli koşullar altında, örneğin, asidifikasyon saf hücrelerde daha uzun bir süre devam edebilir. Bu nedenle, her ölçüm döngüsü kez daha yukarıdaki programda &quot;bekle&quot; süresini uzatmak veya tekrar etmek gerekebilir. </li><li> Program başlar. (Istendiğinde) kalibrasyon adımından sonra, tahlil plaka için kalibrant plakasını değiştirin. Not Yazılımı kullanılarak, benzer koşullar kuyularda gruplarını işaret etmek mümkündür. Buna ek olarak, kontrol oyukları olan kuyu göstermek için çok önemlidir (Bu protokol, bu plaka, dört köşe) ve boş olan kuyu gösterir. Daha detaylı bilgi için, adım adım bunu makineyi kurmak ve için protokolin yazılım, üreticinin web sitesini danışılmalıdır. </li></ol></li><li> Protein İçeriği Ölçme <ol><li> hücreleri bozmadan her bir kalan deney ortamını çıkarın. NOT: Bu protein konsantrasyonu deneyi devam etmek için uygun değildir, bu analize kadar -20 ° C &#39;de bütün plaka dondurmak mümkündür. donmuş, devam etmeden önce Çözülme. </li><li> (50 ul için yeterli / oyuk) RIPA liziz ortamı içinde proteaz inhibitörleri 1 x çözeltisi (100X&#39;lik bir stok) hazırlayın. </li><li> her bir proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 50 ul RIPA liziz ortamı ekleyin. 5 dakika süre ile bir çalkalama plakası ajitasyon ve daha sonra tam olarak lize hücrelere 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe levhasını. </li><li> bunlar bisinkoninik asit (BCA) deneyi karışmaz şekilde plakanın alt lipidler ve diğer moleküller getirmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de plaka dönerler. </li><li> üreticiye göre BCA protein konsantrasyonu ölçmek &amp;# 39; ın önerileri. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+and+reversing+tumor+immune+suppression.">Deciphering and reversing tumor immune suppression.</a> Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).</li><li>Akkaya, M., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+pathogens+drive+the+evolution+of+paired+receptors?.">How do pathogens drive the evolution of paired receptors?.</a> Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).</li><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation.">T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).</li><li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines.">Proinflammatory cytokines.</a> Chest. 118 (2), 503-508 (2000).</li><li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+B+cells.">Memory B cells.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+immunity:+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function.">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454 (2013).</li><li>Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathways+in+T+cell+fate+and+function.">Metabolic pathways in T cell fate and function.</a> Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).</li><li>Doughty, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor-mediated+changes+in+glucose+metabolism+in+B+lymphocytes:+role+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+in+the+glycolytic+control+of+growth.">Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth.</a> Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).</li><li>Caro-Maldonado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+is+required+for+antibody+production+that+is+suppressed+in+anergic+but+exaggerated+in+chronically+BAFF-exposed+B+cells.">Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells.</a> J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate.">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464 (2015).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Klein, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+different+cell+isolation+techniques+on+lymphocyte+viability+and+function.">Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function.</a> J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).</li><li>Hsueh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Mouse+Splenic+B+Lymphocytes.">Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes.</a> AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).</li><li>Zambrano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+ex+vivo+expansion+and+differentiation+of+naive+murine+CD43+B+splenocytes.">Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes.</a> Biotechnol Prog. , (2016).</li><li>Costa, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+rare+populations+of+murine+antigen-specific+T+lymphocytes+by+retroviral+transduction+for+potential+application+in+gene+therapy+for+autoimmune+disease.">Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease.</a> J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).</li><li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers.">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li><li>Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphocyte+subsets+and+their+immunoregulatory+roles+in+burn+injury+and+sepsis.">Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis.</a> J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9 (2001).</li><li>Akkaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+Versatile+Antibody-Based+Barcoding+Method+for+Flow+Cytometry.">A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry.</a> J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).</li><li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects.">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li><li>Wick, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+Primary+Metabolic+Block+Produced+by+2-Deoxyglucose.">Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose.</a> J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+system.">Inhibitors of the ATP synthetase system.</a> Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).</li><li>Terada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncouplers+of+oxidative+phosphorylation.">Uncouplers of oxidative phosphorylation.</a> Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).</li><li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements.">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PLOS ONE. 11 (3), e0152016 (2016).</li><li>Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cell+surface+antigens:+nomenclature+and+immunophenotyping.">Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping.</a> J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).</li><li>Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+T+cell+memory+markers+CD62L+and+CD44+on+murine+draining+lymph+node+cells+following+allergen+and+irritant+treatment.">Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

protokolünün ardından glikoliz ve mitokondriyal solunum performans farklılıkları değerlendirmek üzere farklı konsantrasyonlarda hücre dışı akı analizde kullanılmıştır saf ve uygun bir lenfosit alt, etkin izolasyonu için izin geliştirilmiştir. Bu protokol, lenfositler için özel olarak tasarlanmış ve, düşük bazal metabolizma aktivitesi, kırılganlık, düşük frekanslı olarak bu hücre tipleri, ilişkili özel durumlar adreslerini ve yetersizlik deney plakalara yapışmaya edilir. Bu nedenle, daha önce yayınlanmış protokolleri 11,12 oranla, bizim yöntem immünoloji alanında çalışan araştırmacılar için daha uygun ve daha iyi optimize edilmiş rehber sunuyor. Saf ve canlı hücre popülasyonları elde optimum izdiham hücreleri kaplama ve her bir protein konsantrasyonuna dışı akı tahlil ölçümleri standartlaştırılması da dahil olmak üzere bu protokolü birkaç kritik adımlar vardır. benikisi de ışık mikroskobu ile görüntülendi edilebilir ve kaplama hücrelerin nitial sayısı protein konsantrasyonu ölçümleri kullanılarak ölçülebilir. Hücre sayısı ve protein konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki protein konsantrasyonu, gerçekten de, farklı kuyular arasında hücre sayıları değişikliklerin etkilerini standardize etmek için bir yol olarak kullanılabileceğini teyit etti. Protein konsantrasyonları ECAR ve OCR sonuçları standartlaştırma ile, gösterdiğimiz, bu daha düşük hücre izdiham rağmen birkaç 5 ila 10 x 2.5 olarak hücre / oyuk veri kaliteden ödün vermeden en tahlillerinde kullanılabilir şekilde. Ancak, hücre tipleri ve tahliller arasında değişmektedir kullanılan olabilir hücrelerin alt sınırı. Gibi az 5, 10 x 1.25 hücre, B hücre OCR ölçümleri, daha 2.5 x 10 5 hücre / için kullanılabilir Örneğin, iyi, aynı hücre tipinin glikolitik performansını değerlendirmek için yeterli değildi. Bu yüzden, uzun bir hücre sayısı, sınırlayıcı bir faktör olmadığı için üzerinde en kaplamaYaklaşık 5 x 10 5 lenfositlere karşılık% 90 birleştiği, / de tercih edilir. Ayrıntılı optimizasyon gerekli olabilir zaman hücreleri farklı boyutlarda-böyle önceden etkinleştirilmiş ve kısmen farklılaşmış lenfositler-Kullanılan olarak. Daha önce kültürlenmiş primer lenfositler ile, ayrıca, ölü yana hücre sayısının bir ölçüsü olarak protein konsantrasyonu güvenilirliğini azaltacaktır farklı tedavi koşulları arasında hücre canlılığında bir varyasyon olabilir veya ölmekte olan hücre, aynı zamanda, ölçülen protein düzeyleri katkıda . Bu gibi durumlarda, sitometri dışı akı deneyleri yapılmadan önce akışı ile canlı hücreleri sıralamak için yararlı olabilir. taze izole ve son derece canlı lenfosit toplulukları kullanarak tahlillerde, biz de OCR ve ECAR ölçümleri için güvenilir işlevsel veriler elde. Tüm hücre tipleri mitokondriyal stres testinde benzer davrandığını iken, hücre tipleri arasında çarpıcı farklar vardıglikoliz stres testinde gözlenen. Örneğin, saf T hücrelerinin glikolitik performansı splenositler veya B hücreleri ile karşılaştırıldığında düşük ve oligomycin ilavesi ile değişmemiştir. Bu gözlem, bizim protokol geçerliliğini teyit önceden yayınlanmış çalışmalarla 7,30 ile uyumludur. Sonuç olarak, yöntem, bir hücre dışı akış analiz cihazı kullanılarak lenfosit metabolik aktivitesi test etkili ve uygun bir yol sunar ve bu aktivasyon, hücre farklılaşması veya son bağlı bağışıklık hücreleri metabolik değişiklikleri keşfetmek immünolojik çalışmalar çeşitli yararlı olabilir böyle enfeksiyon, otoimmünite ve hematolojik kanserlerde olduğu gibi hastalık fenotipleri.

antijenlere karşı bağışıklık tepkisi, bağışıklık aktivasyonu ve bağışıklık bastırılması arasında sıkı bir şekilde düzenlenmiştir dengedir. Bağışıklık bastırılması, sadece bu olayları engellemekte ve bu nedenle gereksiz immün yanıtları 1-6 önlenmesi açısından önemlidir ise immün aktivasyonu, uyarıcı yanıt olarak hızlı hücre proliferasyonunu ve göçünü, hem de sitokin üretimi, antikor sekresyonu ve artan fagositozu sürer. Son çalışmalar, bir doğrudan bağ, bağışıklık hücrelerinin aktivasyon durumu ve çeşitli metabolik yolların 7 aktivitesi arasında var olduğunu göstermiştir. Bağışıklık hücreleri ve kapalı enerji üreten yollar geçiş yaparak dinlenme ve aktive devletler arasında geçiş yapabilirsiniz. Ayrıca, farklı bağışıklık hücre tipleri aktivasyonu sırasında artan enerji ihtiyaçlarını yakıt farklı metabolik stratejiler kullanabilir gözlenmiştir. Örneğin, ise T lenfositlerin aktivasyonu neredeyse tamamen glikolitik durum 8 içine hücreleri yönlendirir </su&gt; p aktive B lenfositleri glikoliz ve oksidatif fosforilasyon 9,10 bir denge kullanın. Bu çalışmalar hücre metabolizması üzerinde bağışıklık hücre aktivasyonu etkilerini araştıran önemine işaret etmektedir. Gerçek zamanlı, oksidatif fosforilasyon ve glikoliz göstergeleri olarak oksijen tüketim hızı (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR), eşzamanlı ölçümler, enerji üreten yolların 11-13 durumlarını gidermek için bir ortak stratejidir. Bu amaca ulaşmak için, bu tür Hippocampus XF 96 gibi bir hücre dışı akı Analiz Cihazı, rutin olarak kullanılır. Böyle bir alet hızla hücre tipleri arasında veya farklı stimülasyon koşullarına bağlı OCR ve ECAR değişiklikleri karşılaştırabilirsiniz. Şimdiye kadar, bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri, bu cihazlar kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, özellikle bağışıklık hücreleri için tasarlanmış optimize edilmiş bir protokol kullanılamaz. Bağışıklık hücreleri, özellikle lenfositler, ot farklıpek çok kritik yollarla onu hücre tipleri. Lenfositler ex vivo koşullar 14-16 uzun süreli hayatta olmayan hassas hücrelerdir. Bu, optimal büyüme ortamı örneğin hücre dışı bir akış analizi kullanılanlar gibi, gerekli besinleri yoksun kültürlenmiştir daha büyük bir sorundur. makrofajlar ve pek çok hücre çizgileri farklı olarak, lenfositler, plastik yüzeylere yapışmayan; nedenle stresi oluşturmadan analiz plaka bunları takmak için kritik öneme sahiptir. Son olarak, bazı lenfosit alt popülasyonlar son derece nadir olabilir ve gerekli optimum miktarda onları hasat 17-19 zor olabilir. Burada, özellikle lenfositler için geliştirilmiş bir optimize edilmiş bir protokol sağlar. Biz ayırıcı onların istirahat devlet glikoliz ve oksidatif fosforilasyon özelliklerini göstermek 20 düğümleri fare dalak ve lenf yalıtılmış splenositlerin B lenfositleri ve naif CD4 + T lenfositleri kullanılarakT hücre yoğunlukları. Veriler, hücre sayıları ile doğru orantılı olduğu son deney hücre lisatı, protein konsantrasyonları, ölçülerek her biri için başlangıç ​​Hücre sayılarındaki farklılıklar için normalize edildi. Bizim protokol sadece hücre dışı akı deneyleri için canlı lenfositlerin hızlı izolasyonu için yönergeleri sağlar, ama aynı zamanda veri kalitesinden ödün vermeden optimal hücre konsantrasyonları çalışma sağlar.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7.2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8</td><td>Quality Biological</td><td>10128-446</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>autoMACS rinsing solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Contains phenol red and L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 &amp;deg;C water bath and then inactivate at 56 &amp;deg;C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 &amp;deg;C until needed.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 &amp;deg;C until ready to make media.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Component of RF10 and stress test media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Component of RF10 and stress test media</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>CellTrics 30 &amp;mu;m cell filter, sterile, single-packed</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>B Cell Isolation Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Na&amp;iuml;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>MidiMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Magnet for separation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Holder for magnets</td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td></td><td>130-091-222</td><td>Rinsing solution for autoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis.</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Follow manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Used to prepare stress test media</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>Used to sterile filter media.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak.</td></tr></tbody></table>

an optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes

Lenfositler da hızlı bir hücre proliferasyonu, migrasyon ve farklılaşma ve sitokin üretimine yol açan hücre içi sinyal yollarını aktive ederek çeşitli uyaranlara karşı yanıt. Bütün bu olaylar sıkıca hücrenin enerji durumuna bağlı ve bu nedenle enerji üreten yollarını inceleyerek bu hücrelerin genel işlevselliği hakkında ipuçları verebilir. hücre-dışı akı analiz, birçok hücre tipinde glikoliz ve mitokondriyal solunum performansını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir cihazdır. Bu sistem birkaç yayınlanan raporlarda bağışıklık hücrelerini incelemek için kullanılır olmuştur, ancak lenfositler için özellikle optimize kapsamlı bir protokol yoktur. Lenfositler ex vivo koşullarda kötü hayatta kırılgan hücrelerdir. Çoğu zaman lenfosit alt grupları nadirdir ve düşük hücre sayıları ile çalışan kaçınılmazdır. Bu yüzden, bu problemlere yöneliktir deneysel strateji gereklidir. Burada, bir protokol sağlarBu lenfoid dokulardan uygulanabilir lömfositlerinin hızlı izolasyonu sağlar ve hücre dışı akı analizatöründe metabolik durumlarının analizi için. Ayrıca, farklı hücre yoğunluğunda birkaç lenfosit alt tipleri metabolik aktiviteleri karşılaştırıldığı deneylerin sonuçlarını verir. Bu gözlemler, protokol daha düşük hücre konsantrasyonlarında tutarlıdır ve iyi standardize edilmiş sonuçlar elde etmek için kullanılabilir ve bu nedenle bağışıklık hücreleri metabolik olaylar karakterizasyonu odaklanarak daha sonraki çalışmalarda geniş uygulamalara sahip olabileceğini göstermektedir.

Ökaryotik hücreler glikoliz entegre ağ kullanımı trikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon enerji talep çoğunluğu karşılamak ve hücre büyümesi ve çoğalması için gerekli olan ara maddeler elde edildi. Bu yollar, daha sonra piruvata içine işlenmiş alır glikoz-6-fosfatı formunda serbest glukoz hücre yakalama ile başlar. Piruvat ya azalmış laktat ya da asetil koenzim A oluşturan mitokondri, (CoA) taşınır etmektir. Asetil CoA sonra TCA döngüsü içine girer. TCA döngüsünün yüksek enerjili ara sırayla iç mitokondrial membran genelinde bir H + degrade oluşturmak için mitokondriyal matrisinden H + dışarı attıktan elektron taşıma zinciri (ETC), elektronların hareketini itmek. Oksijen nihai elektron alıcısı olarak hareket eder ve H + K O / F &lt;aracılığıyla mitokondrial matriks geri dönmekalt potansiyel enerjisi ATP (Şekil 1A) oluşturmak için kullanılır&gt; 1 kompleksi. Hücre dışı akı testinin çalışma prensibi belirli noktalarda glikoliz ve oksidatif fosforilasyon ile müdahale ve ortaya çıkan etkilerini değerlendirmek bağlıdır. Bu amaçla, engellemek için, aç hücrelerde glikoliz ve heksokinaz tarafından 2-deoksiglukoz-6-fosfat, fosfoglukoizomeraz 23 rekabetçi bir önleyicisi dönüştürülür 2-deoksiglukoz (2-DG), yaymak için glukoz kullanılır glikoliz. Rotenon (ETC kompleks I spesifik bir inhibitör), (ATP sentaz 24 inhibitörü) oligomycin, A (bir kompleks ETC III spesifik inhibitörü) antimycin ve sökme maddesi 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 idi ulaşım, proton degrade ve ATP sentezini (Şekil 1A) elektron ilgili belirli olayları müdahale için kullanılır. Bunun yerine 2,4-DNP bölgesinin karbonil cyasiyanid-4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) da kullanılabilir, ama daha fazla optimizasyon gerekli olabilir. Her iki durumda da, eşleşmeyenler her zaman gerekli optimal konsantrasyonunu belirlemek için kullanılmadan önce, belirli bir hücre tipi için titre edilmelidir. Glikoliz stres testi (Şekil 1B), daha önce aç hücrelerinde hücre dışı asidifikasyon oranı (ECAR) bir temel değer ölçümü başlar. Bu hücreler bazal en az, ve bu nedenle pratik olmayan glikolitik olarak kabul edilebilir olduğundan, bu noktada ölçülen ECAR olmayan glikolitik asitleştirme olarak adlandırılır. Ve H + - Bu asitlenme muhtemelen TCA döngüsünde oluşturulan solunum CO 2 HCO 3 dönüştürülür karşılık gelir. Bu, laktat oluşmasına hücre dışı asitleşme bir artış olarak kendini gösteren, glikoliz aktif hale getirmek için glukoz enjeksiyonu takip eder.Bu artış glikoliz normal hızını temsil eder. Hücreler daha sonra, blok oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimi oligomycin enjeksiyonu ile zorlanmaktadır. Hücreler maksimum seviyeye glikoliz aktive ederek ATP üretimi bu dramatik düşüşün tepki ve bu ECAR düzeyinde (glikolitik rezerv) ikincil bir artış ile sonuçlanır. Test glikoz analog non-glikolitik düzeye ECAR döndürür 2-DG kullanarak glikoliz toplam önlenmesi ile sonlandırılır. İlginçtir, o üreticinin tavsiyelerine aykırı, maksimal glikoliz mutlaka 26 oligomycin enjeksiyonu ile elde edilmez, ileri sürülmektedir. ATP talepte önemli bir artış yoksa yüksek glikolitik kapasiteye sahip hücrelerde, glikoliz bu up-regüle olması gerek kalmadan mitokondriyal ATP kaybı ile baş mükemmel mümkün olabilir. oligomycin ile glikolitik oranı, solunum inhibitörleri eklenerek aştı olabilirBöyle oligomycin üzerinde birkaç faydalar sağlayan rotenone ve myxothiazol gibi: Onlar ATP Sentaz&#39;ın ters neden olarak 1) Onlar 26 mitokondrial membran potansiyeli kurtarmak için bir girişim protonları pompalamak için, ATP hidrolizi ile, ATP talebi arttırmak; 2) Bu ECAR sonuçları (aşağıya bakınız) etkilemesi için orta, solunum asitleştirme engeller. ATP talebi artırmak için diğer yöntemler, plazma membran ATPazların 26 ile ATP hidroliz uyaran bileşiklerin ilave edilmesi yer alır. Bir glikoliz stres testi planlarken tüm bu araştırmacılar tarafından dikkate alınmalıdır. Mitokondriyal stres testi (Şekil 1C) olmayan hasret hücrelerde oksijen tüketim oranı (OCR) bir taban ölçüsü ile başlar. Bu F O / F 1 kompleksi ile protonların geri dönüşünü engelleyen oligomycin enjeksiyonu izledi ve böylece hızla hyperpolariz edilirmitokondriyal membran es. Hiperpolarizasyon solunum kompleksleri sayesinde pompalama ileri proton ve solunum hızı azalır önler. Kalan solunum lipidler ya da diğer kanallardan protonların akışını temsil eden proton sızıntısı, denir. Bu hiperpolarize durumu hızlı bir şekilde bir proton iyonofor olarak hareket sökme maddesi 2,4-DNP eklenmesiyle ters çevrilir. Buna karşılık, hücreler kendi maksimum elektron transport hızını artırarak bir beyhude girişimi zar potansiyelini kurtarmak için deneyin ve bu da OCR arttırır. Son olarak, iki ETC inhibitörleri (antimisin ve rotenone) eklenmesi ile, mitokondriyal solunum tamamen durur ve OCR en düşük seviyesine düşer. Bu seviyede, oksijen tüketimi mitokondriyal aktivite (non-mitokondrial) bağlı değildir. Bu inhibitörleri tarafından oluşturulan OCR fark bazal solunum ve yedek kapasite toplamı maksimum mitokondriyal solunum denir. <pfo class = &quot;jove_content&quot;: keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; B ve T hücre izolasyonları son derece canlı, saf lenfosit toplulukları verim. Protokol Bölüm 4&#39;te tarif edilen B hücreleri ve naif CD4 + T hücrelerinin izole edildi ve splenositler, sadece Bölüm 3.3 de tarif edildiği gibi, kırmızı kan hücrelerinin lize edilmesi ile elde edilmiştir. hücre tipi özel, metabolik deneyleri duyarlılığı canlılığı ve başlangıç ​​hücrelerinin saflığı bağlıdır. Bu nedenle, izole edilmiş bir fare T-hücreleri, splenositler, ve B hücreleri ve T ve B hücrelerinin saflığı canlılığı teyit etmek için, hücre az miktar akış sitometrik analizi (Şekil 2) için boyandı. Yan dağılım alan vs ileri dağılım-alanda (FSC-A SSC-A vs) arsa, lenfositler kapılı edildi ve bu kapıdan öne dağınık yüksekliğe diyagonal boyunca nüfus içindeFSC-A arsa vs t (FSC-H) singletlerin olarak belirlendi. Tekli nüfus içinde, canlılık canlı / ölü işaretleyici (Şekil 2A) için negatif boyanan hücreler yolluk ölçüldü; T hücresi canlılığı splenosit yaşayabilirliği% 92, ve B hücre yaşayabilirliği% 94,% 97.9 idi. CD4 + grubu 27,% 98.3 (Şekil 2B) olan -, CD44 ile ölçülen, CD4 + T hücre saflık ise B hücresi saflığı B220 + CD19 + popülasyonunun 26 ile ölçüldüğünde,% 99 idi. Hücre lizatının protein konsantrasyonu, kaplanmış hücre sayısının doğrudan bir göstergesi olarak da kullanılabilir. İzole edilen lenfositlerin ve splenositler, / 5 x 10 5 hücre bir yapışkan ile kaplanmış 96 oyuklu deney plakası 2.5 x 10 5 hücre / göz, 1.25 x 10 5 hücre / göz ve 0.625 x 10 kaplandı <sup&gt; 5 hücre / göz. Üç hücre tipleri, her plaka yoğunluğunda izdiham ışık mikroskobu (Şekil 3A) altında görüntülendi. Beklendiği gibi, kesişme ilk kaplama yoğunlukları ile bağlantılıydı. hücre-dışı akış testinin tamamlanmasının ardından, kaplama hücreler lize edildi ve protein konsantrasyonları BCA deneyi kullanılarak ölçüldü. Tüm hücre tipleri için, lizat protein konsantreleri doğrusal hücre dışı akış verileri yorumlanırken lizat protein konsantreleri hücre sayıları normalleştirilmesi için kesin bir ölçü olarak kullanılabilir doğrulamaktadır ilk kaplama yoğunlukları (Şekil 3B) ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu deneyde kullanılan kaplama yoğunlukları naif, uyarılmamış lenfositler için optimize edilmiştir. uyarılmış ya da önceden kültürlenmiş hücreler kullanılacak ise, daha fazla optimizasyon gerekebilir. Mitokondriyal ve glikolitik stress tahlilleri plakalı hücre sayısına bağlıdır. OCR hücre dışı akı analizörü her hücre tipi ve plaka yoğunluğunda ölçülmüştür. Beklendiği gibi, daha yüksek hücre sayısı daha yüksek ölçülmüş OCR, hem de daha dramatik yanıt oligomycin için, 2,4-DNP ve antimisin / rotenon (Şekil 4A) sahiptir. Her bir numune, protein konsantrasyonu OCR ölçümleri standartlaştırılması, genel olarak, hücrelerin daha büyük sayıda daha doğru OCR ölçümleri neden olduğunu ortaya koymaktadır. 5 ve 2.5 x 10 5 hücre Kaplama / oyuk, T hücreleri ve dalak ve 5 1.25 x 10 5 hücre içindeki normalize OCR ölçümleri ile sonuçlanmıştır / B hücreleri (Şekil 4B) içindeki normalize OCR ölçümleri elde edilmiştir. Normalize B hücresine ufak farklar OCR ölçümleri B hücreleri / diğer hücre yoğunlukları ile karşılaştırıldığında 2.5 x 10 5 hücre daha iyi performans gösterdiğini dolaylı göstergesi olabilir. Tüm önlemlere göre, 0.625 x 10 5 hücre / kuyu bu kaplama yoğunluğu yetersiz olduğunu gösteren, optimal sonuçlar verdi. Temel dönemi solunumu, proton sızıntısı maksimum mitokondriyal solunum olmayan mitokondriyal solunum ve ATP üretimi doğrusal, tüm hücre tipleri (Şekil 4C) için kaplama yoğunlukları ile korelasyon. üç hücre türünden düşük proton sızıntısı belirtildiği gibi Ayrıca, bazal solunum çoğu, ATP sentezlemek doğru kullanılır. mitokondriyal stres deney odak noktası OCR değişiklikleri ölçmek için ise, ECAR tahlil başarıyla gerçekleştirildi sağlamak için kaydetmek için yine de yararlıdır. OCR benzer şekilde, iki daha yüksek kaplama yoğunluğu yüksek ECAR ve oligomycin daha dramatik tepkiler 2,4-DNP ve antimisin / rotenone (Şekil 4D) ile sonuçlanmıştır. 2,4-DNP ilavesi üzerine ECAR ve antimisin / rotenone dramatik değişiklikler, g değişikliklerin yanı sıra solunum değişikliklere bağlı olabilirve H + - lycolysis, CO TCA döngüsünde oluşturulan 2 yana HCO 3 dönüştürülür. Bu konu son zamanlarda ele, ve gerçek glikolitik oranı 12,29 elde etmek için, oksijen tüketim verileri kullanılarak toplam hücre dışı asitlenme sinyalini düzeltmek için basit bir yöntem söz konusudur edilmiştir. Glikoliz stres tahlil yüksek kaplama yoğunluğu (Şekil 5A, B) en başarılı oldu. Tüm hücre tiplerinde, 5 x 10 5 hücre / göz örnekleri oligomycin, glukoz ilave edildikten sonra ECAR en büyük değişiklik vardı, ve 2-DG (Şekil 5B). Ayrıca, protein konsantrasyonu normalleştirilmesi düşük konsantrasyonlar özellikle 0.625 x 10 5 hücre / kuyu-did sağlam bir glikolitik rezerv kapasitesini göstermez iken, tüm hücre tipleri için, 5 x 10 5 hücre / kuyu örnekleri, optimum sonuçlar vermiştir olduğunu göstermiştir. Sigara glycolytiCı asitleştirme, glikoliz ve belirgin glikolitik kapasitesi doğrusal, tüm hücre tipleri (Şekil 5C) için kaplama yoğunlukları ile korelasyon. glikoliz gerilme deneyi için, OCR grafiği glukoz biraz sonra oligomycin muamele ile engellenmektedir mitokondriyal solunum, uyardığını göstermektedir; 2-DG eklenmesi OCR (Şekil 5D) etkilememiştir. OCR grafik glikoliz stres deney başarıyla gerçekleştirildi başka bir göstergesi olarak kullanılabilir. Ayrıca, OCR grafiği mitokondriyal stres testi 12,29 halinde, yukarıda açıklandığı gibi, gerekirse ECAR grafik düzeltmek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig1.jpg" /> Şekil 1:. (Solda) glikoliz dışı akı tahlillerin Anahat (A) İllüstrasyon ve oksidatif fosforilasyon (sağda) eylem gösterenhücre-dışı akı deneylerinde kullanılan metabolik ilaçlar. (B), hücre dışı asidifikasyon oranı (ECAR) grafiğinin şematik; oksijen tüketim hızı (OCR) grafiğin (C) şematik. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig2.jpg" /> . Şekil 2, T hücreleri, B hücreleri ve canlılığı ve saflığı belirlemek için splenositlerin Aşamalı yolluk sitometrisi T hücreleri, dalak ve B hücrelerinin canlılığı (A) gösteren grafikleri akış; ve T ve B hücreleri (B) &#39;nin saflığı. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">Th büyük halini görmek için tıklayınız</a>rakamdır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54918/54918fig3.jpg" /> Şekil 3:. Celi izdiham farklı kaplama yoğunluklarında, her hücre tipinin lisatı, protein konsantrasyonları ile ilişkilidir (A) x 10 5 hücre 5 x 10 5 hücre / kuyucuktan 0.625 arasında değişen kaplama yoğunluklarında deney plakası gözleri içindeki hücreler hafif mikrograflan / iyi. Ölçek çubukları 50 uM belirtir. BCA deneyi ile ölçülen farklı kaplama yoğunluklarında (B) Lizat protein konsantreleri. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54918/54918fig4.jpg" /> Şekil 4:<html> Her bir hücre tipi ve kaplama yoğunluğu için mitokondriyal stresi deneyi. Ham (A) ve standart (B) OCR gösterilmiştir. (C) başlangıç maksimum mitokondriyal olmayan mitokondriyal solunumun seviyeleri, hem de proton sızıntısı veya ATP üretimi bağlanmış olan oksijen tüketimi Hücre sayısı bağımlı değişiklikler, her hücre türü için gösterilmiştir. Mitokondriyal stres testlerinden elde edilen (D) Ham ECAR değerleri gösterilmiştir. Her veri noktası, standart sapma 7-8 çanağın ortalamasını temsil eder. Etiketli oklar oligomycin enjeksiyonları (O), 2,4-DNP (D), rotenon / A (R / A) antimycin ifade etmektedir. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> _upload / 54918 / 54918fig5.jpg &quot;/&gt; Şekil 5:., Her bir hücre tipinde ve kaplama yoğunluğu için Glikolitik gerilme deneyi Ham (A) ve standart (B) ECAR gösterilmiştir. (C) olmayan glikolitik asitleştirme, glikoz ile uyarılan glikoliz ve toplam glikolitik kapasitesi ECAR hücre sayısı bağımlı değişiklikler gösterilmektedir. Glikolitik stres testlerinden elde edilen (D) Ham OCR değerleri gösterilmiştir. Her veri noktası, standart sapma 7-8 çanağın ortalamasını temsil eder. Etiketli oklar, glikoz (G), oligomycin (O) ve 2-deoksiglukoz (2-DG) enjeksiyonları ifade etmektedir. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes at JoVE.com

Lenfositlerde Glikoliz ve Mitokondriyal Solunumu Analiz Etmek İçin Optimize Edilmiş Bir Protokol | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

an-optimized-protocol-to-analyze-glycolysis-mitochondrial-respiration

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cellular Respiration

SCIENTISTS IN ACTION

29.5K Görüntüleme.  National Institutes of Health. The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Video: An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.

Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Gelişim Biyolojisi

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measuring Yeast Mitochondrial Respiration While Maintaining Cellular Context

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to different nutritional and environmental conditions give valuable information to elucidate molecular mechanisms. Oxidative phosphorylation is the primary source of ATP in most cells, and mitochondrial respiration activity is a key component of oxidative phosphorylation, maintaining mitochondrial membrane potential for ATP synthesis. Mitochondrial respiration is often studied in isolated mitochondria that are missing the cellular context. Here, we present a method for quantifying mitochondrial respiration in yeast-intact cells. This method applies to any yeast species, although it has been generally used for Saccharomyces cerevisiae cells. First, the yeast growth in specific conditions is tested. Then, cells are washed and resuspended in deionized water with a 1:1 ratio (w/v). Cells are then placed in an oximeter chamber with constant stirring, and a Clark electrode is used to quantify oxygen consumption. Some molecules are sequentially placed into the chamber and selected according to this effect on the electron transport chain or ATP synthesis. ATPase inhibitor oligomycin is first added to measure respiration coupled to ATP synthesis. Afterward, an uncoupler is used to measure the maximal respiratory capacity. Finally, a mix of electron transport chain inhibitors is added to discard oxygen consumption unrelated to mitochondrial respiration. Data are analyzed using a linear regression to obtain the slope, representing the oxygen consumption rate. The advantage of this method is that it is specific for yeast mitochondrial respiration, maintaining the cellular context. It is essential to highlight that inhibitors used in mitochondrial respiration quantification could vary between yeast species.

Mitochondrial respiration in yeast whole cells is a valuable indicator of cell bioenergetics. Here, we present a protocol to quantify this phenotype applicable to different yeast species.

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

Biyokimya

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is indispensable for T cell activation, and the survival of memory T cells is dependent on mitochondrial remodeling. Consequently, this affects the long-term clinical outcome of cancer immunotherapies. Changes in T cell quality are often studied by flow cytometry using well-known surface markers and not directly by their metabolic state. This is an optimized protocol for measuring real-time mitochondrial respiration of primary human T cells using an Extracellular Flux Analyzer and the cytokines IL-2 and IL-15, which differently affect T cell metabolism. It is shown that the metabolic state of T cells can clearly be distinguished by measuring the oxygen consumption when inhibiting key complexes in the metabolic pathway and that the accuracy of these measurements is highly dependent on optimal inhibitor concentration and inhibitor injection strategy. This standardized protocol will help implement mitochondrial respiration as a standard for T cell fitness in monitoring and studying cancer immunotherapies.

Metabolic adaptation is fundamental for T cells as it dictates differentiation, persistence, and cytotoxicity. Here, an optimized protocol for monitoring mitochondrial respiration in ex vivo cytokine-differentiated human primary T cells is presented.

Sitokin Diferansiye İnsan Primer T Hücrelerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı İzlenmesi

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Biyoloji

Analyzing Ex Vivo Metabolic Flux in Splenic and Cardiac Macrophages and Bone Marrow Monocytes

Metabolic reprogramming is a hallmark of monocyte/macrophage activation and polarization between pro- and anti-inflammatory states. For example, pro-inflammatory (i.e., M1-like) monocytes/macrophages display more reliance on anaerobic glycolysis and less reliance on mitochondrial oxidative phosphorylation, whereas anti-inflammatory (M2-like) macrophages display more reliance on glucose and fatty acid oxidation in the mitochondria. Here, we describe in-depth protocols for extracting macrophages from the two major monocyte/macrophage reservoirs in the body, the spleen and bone marrow, as well as injured tissues such as the heart following myocardial infarction.
Macrophages or monocytes are extracted by immunomagnetic sorting by using antibody-tagged microbeads, which easily bind to cells without compromising their phenotypes. The extracted cells are then cultured in 96-well plates, followed by extracellular flux analysis using a metabolic flux analyzer. Both glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation can be measured simultaneously in small numbers of cells (as little as 2-3 &#215; 105 cells). This method can easily be performed in 1 day and produces reliable and repeatable results. Ultimately, these methods help to enhance our understanding of metabolic changes during immune and inflammatory responses to injury and disease, which could lead to the development of novel therapeutic targets for immunometabolic pathways.

Here, we describe in detail methods for extracting macrophages from the bone marrow, spleen, and infarcted heart, and subsequently assessing metabolic flux in live cells.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Metabolic reprogramming is a hallmark of monocyte/macrophage activation and polarization between pro- and anti-inflammatory states. For example, ...

Measuring Mitochondrial Function of Na&#239;ve and Effector CD8 T Cells

Understanding how immunometabolism impacts the function, differentiation, and fate of lymphocytes has garnered significant interest and attention. Lymphocyte biology has been explored using bioenergetic analysis and has now become a critically import tool in the field. Thus, we sought to optimize a bioenergetic analysis assay that can be adapted with pretreatments and acute injection for receptor stimulations. Here, we evaluated CD8 T cell ex vivo metabolism using the Cell Mito Stress Test to assess rates of oxygen consumption and extracellular acidification in na&#239;ve and effector CD8 T cells. Antigen-specific effector CD8 T cells were derived via ex vivo stimulation, and na&#239;ve CD8 T cells harvested from splenocytes and isolated with magnetic bead column separation. 
Pretreatments are performed in microplates and we detail how to prepare sensor cartridges. We show how injection ports can loaded with drugs to indirectly measure metabolic capacities and with metabolic modulators, this protocol can be used to study specific enzyme activity. T-cell receptor stimulations can be studied in real time with acute injection and stimulation with anti-CD3/CD28 using the injection ports. Instrument analyzers are used for measurements and data collection and data visualization is done with software programs to interpret cellular metabolism. This strategy produces an extensive amount of data on immune cell biology and mitochondrial bioenergetics allowing researchers to customize the protocol in numerous ways to explore CD8 T cell metabolism.

CD8 T cell bioenergetics can be interrogated using the Mito Stress Test. This methodology can be used to study acute and chronic metabolic programming. This protocol describes approaches to examine the relationships between T cell receptor biology and bioenergetic analysis.