Yüzey plazmon rezonans spektroskopisi, protein ligandının orta verimde belirlenmesi için kurulmuştur. Aynı molekülün bağlanma bölgesi varyantları için, yani virüsler üzerindeki demir bağlayıcı yüksek görgü oligosakkaritleri için farklı afiniteler sunulmaktadır. SPR, yüzey immobilize reseptörlerinin gerçek zamanlı makromoleküler bağlanmasını incelemek için etiketsiz bir tekniktir.
Çok bölgeli etkileşimler, kinetik analizde, SPR kullanan araştırmalardaki spesifik alanların boyutundan bağımsız olarak rekabetçi bağlanma ile tanınır İnhibitörleri veya antikor karakterizasyonunu aramak için ilaç geliştirmedir. Kinetik sabitler ve benzeşimler doğrudan sensör tepkisinden hesaplanır. Başlamak için, çözeltinin 100 mikrolitresini LB-agar plakalarına aktarın ve steril bir hücre yayıcı kullanarak yavaşça yayın.
Astar konsantrasyonunu sabit tutarken beş ila 50 nanogram arasında değişen çift sarmallı DNA şablonunun çoklu konsantrasyonlarını kullanarak bir dizi numune reaksiyonu başlatın. Daha sonra mineral yağ kaplamasının altına DpnI kısıtlama enzimini ekleyin ve ebeveyn süper sarmal çift sarmallı DNA'yı sindirmek için bir saat boyunca hemen 37 santigrat derecede inkübe edin. XL1-Blue Süper Yetkin Hücreleri çözmek için, hücreleri önceden soğutulmuş, küçük, yuvarlak tabanlı bir tüpe alikote edin.
Daha sonra, her kontrol ve numune reaksiyonundan DpnI ile muamele edilmiş tek sarmallı DNA'nın bir mikrolitresini, tamamlayıcı ipliği sentezleyen Süper Ehil Hücrelerin ayrı alikotlarına aktarın. Transformasyon reaksiyonlarını karıştırmak için dikkatlice döndürdükten sonra, reaksiyonları 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 45 saniye boyunca 42 santigrat derecedeki dönüşüm reaksiyonlarına ısı darbesi uygulayın ve ardından reaksiyonları iki dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
Daha sonra 0,5 mililitre NZY + Et Suyu ekleyin ve dönüşüm reaksiyonlarını bir saat boyunca 225 ila 250 RPM'de sallayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, daha önce gösterildiği gibi LB Ampisilin Agar plakaları üzerindeki her dönüşüm reaksiyonunun doğru hacmini plakalayın. Bir tohum kültürü için, dönüştürülmüş plakadan tek bir koloni ile LB ortamı içeren az miktarda ampisilin aşılayın.
Gece kültürünü kullanarak, ekspresyon kültürünü 10 milimolar magnezyum klorür, 10 milimolar magnezyum sülfat ve 20 milimolar glikoz içeren katkı maddeleri ile aşılayın ve tohum kültürünü 100'e kadar seyreltin. Daha sonra, hücreleri 20 santigrat dereceye soğutmadan önce 37 santigrat derecede kuvvetli sallanan hücreleri, 0.4 ila 0.6 arasında emici bir 600 nanometreye büyütün ve bir milimolar IPTG ile indükleyin ve gece boyunca büyüyün. Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 g'da santrifüj ederek toplayın ve süpernatanı atın.
Hücre peletini fosfat tamponlu salin tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, son zamanlarda dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 g'da sığınır. Ardından süpernatantı bir pipetle atın. Daha sonra, kalan peleti 10 mililitre lizis tamponunda yeniden askıya alın ve süspansiyonu 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra çözünür ve çözünmeyen fraksiyonları, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 g'da santrifüjleme ile ayırın. Ek olarak, sırasıyla 20 milimolar imidazol ve 250 milimolar imidazol içeren tampon çözeltilerde etiketli rekombinant olarak eksprese edilen siyanovirin-N'yi bağlamak ve yeniden askıya almak için 14 mililitre tüplerde HIS-Select Ni2 + Afinite Jeli kullanın. Bu adımlar arasında toplu olarak en az 30 dakika boyunca inkübe edin.
Proteini yok etmek için 250 milimolar imidazol içeren elüsyon tamponunun eklenmesi. Protein çözeltilerini 10 kilo Dalton kesme filtreli santrifüj tüplerine aktarın ve 4.500 g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj yaparak konsantre edin. SPR çalışma tamponunu bir ila 10 seyreltme faktörüne ekleyin ve 4.500 g ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca başlangıç hacmine dört kez santrifüj yapın.
Daha sonra, 23.474 Dalton büyüklüğünde bir boyut gösteren ana protein CVN2L0 için hesaplanan yok olma katsayısına dayanan bir NanoDrop UV-Görünür Spektrofotometre kullanarak 280 nanometredeki protein konsantrasyonunu belirleyin. Çift kanallı SPR sistemi için, çalışan tampon olarak HBSCP plus, rejenerasyon tamponu olarak pH 1,5 ila 1,6 arasında 10 milimolar glisin hidroklorik asit kullanın ve cihaz degazörü, otomatik numune alma cihazı ve pompayı açın. Daha sonra tüm sistemi bir saat boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
Ardından, daldırma yağını dedektörün üzerine bırakın ve ince bir altın filmle kaplanmış bir cam sensör çipi takın. Ve üst tarafta, karboksimetil dekstran hidrojel ile doğrudan üç portlu akış hücresinin altındaki dedektöre işlevselleştirilmiştir. Ardından, tutamağı aşağı çekerek ayarı düzeltin.
Proteinli ligandları sensör yongalarına hareketsiz hale getirmek için, menü çubuğunda Form'a tıklayarak bir çalışma masası açın ve entegre SPP otomatik bağlantı yazılımında tablo düzenleyicisini çalıştırın. Ardından, mevcut çalıştırma tabloları listesinden Temel İmmobilizasyon'u seçip tıklayın ve bilgisayar ekranındaki deneysel prosedürün adımlarını izleyin. Ardından, daha fazla analiz için otomatik örnekleyiciye yerleştirilen iki rafın reaktif listesini doldurmak üzere form bölümündeki Örnek Kümesi Düzenleyicisi'ne tıklayın.
Rafları öne veya eve getirmek için menü çubuğunda bir araç olarak Otomatik Örnekleyici Doğrudan Kontrolü'ne tıklayın ve çalışma sıcaklığı olarak dört santigrat dereceyi seçin. Aletlere ve pompa doğrudan kontrolüne tıklayarak çift damıtılmış suyu demlemek için pompayı çalıştırın. Ve SPR Instrument Direct Control'e tıklayarak verileri kaydedin.
Ve her seferinde, yeni görünen pencerede başlayın. Kaplin reaktiflerini 300 mikrolitrelik şişelere ekledikten sonra, otomatik numune alma raflarına koyun ve Çalıştır'a tıklayarak çalıştırma tablosunu başlatın. Basit protein-protein etkileşimi için, pompayı dakikada 25.000 mikrolitrede yeniden doldurduktan sonra, 30 saniye boyunca temel ayarlamayı yapın.
Aktif talaş yüzeyini bir molar etanolamin hidroklorür, pH 8.5 ile söndürmeden önce 1,5 dakika boyunca çift damıtılmış su ile sonraki temel ayarlamaya izin verin. Ardından, HBS-EP + Forma tıklayın, aşağı kaydırın ve bu çalışma moduna tıklayarak tüpleri sıvı numune alma cihazından çift damıtılmış sudan şişeye degazöre geçirin. Ardından, her akış hücresi için veri platformunda zaman içinde oluşturulan bağlama eğrilerini seçmek için Ekle'ye tıklayın ve bindirmeyi bir yıkayıcı dosyası olarak dışa aktarın.
Ardından, dosya kaydetme seçeneklerini açmak ve sol ve sağ eğrileri hizalayarak ve ikinci referans kanalının sinyallerini ligand kanalınınkilerden çıkararak yanıt eğrileri elde etmek için Dosya'ya tıklayın. CVN2L0 ve varyans V2 ve V5'in tek enjeksiyonları, ilk olarak otomatik örnekleyici ve çalışan masa editörü kullanılarak bağlanma kapasitelerini tahmin etmek için hemoglutinin kuplajlı sensör çipine bağlanma açısından test edilmiştir. Tekrarlanan enjeksiyonlar, zaman içinde sistemdeki nanomolar ve mikromolar aralıktaki çeşitli konsantrasyonlarda otomatikleştirildi ve çip yüzeyinde doygunluk veya denge bağlanmasının sağlanmadığını gösterdi.
RBD'ye CVN vahşi tip bağlanma için konsantrasyona karşı yanıt çizildi, RBD S1 alt birimindeki muhtemelen korunmuş karbonhidratların, 260 mikromollük bir ayrışma hızı sabitine sahip daha zayıf afiniteli spesifik hedeflemesi varsayıldı. DM'ye CVN2L0-V4 bağlanması için aynı afinite grafiği, küçük glikozile peptitlere yüksek afiniteli bağlanmaya müdahale eden ve yanıt maksimum değerinden daha yüksek bir yanıt veren disülfür bağlarının değiştirilmesi nedeniyle artık analiz edilemez hale gelir. SARS-CoV-2 üzerindeki RBD'ye CVN vahşi tip bağlanması, sırasıyla 18.6 mikromol ve 260 mikromollük bir ayrışma öfke sabiti ile S proteinine ve RBD'ye bağlanmayı gösterir.
Her ne kadar analit konsantrasyonları için SPR yanıtı, CVN vahşi tip ve E41A bağlanması için yüksek yanıt birimleri ve tipik SPR sensörgramları ile sonuçlansa da. Bununla birlikte, mutant seyreltildiğinde kararsızdır. SPR biyosensing, saflaştırılmış proteinlerin ve varyantlarının ligandlara yüksek afiniteli ve düşük afiniteli bağlanmasını ele almaktadır.
Bizim durumumuzda, optik okumayı ve sensör çipi yüzeyindeki çift kanallı akış sistemini kullanan glikoproteinler. İmmünosorbent tahlili olan enzim, protein epitoplarını tanıyan, aynı zamanda karmaşık matrislerden peptitlerin ve küçük moleküllerin konsantrasyonu hakkında veri sağlayan alternatif bir immünolojik yöntemdir. SPR bağlanma tahlilleri ile rekombinant olarak eksprese edilen proteinlerin test edilmesi, hesaplamalı protein tarafı tarafından protein stabilitesinin doğrulanması ve tahmin edilmesi için yararlı olan doğrulamasal değişikliklerin biyosensingini içeriyordu.
