Yazar, oseltamivir sağladıkları için Dr. Yujiro Hayashi ve Hayato Ishikawa'ya ve bağımsız RELIC programlarını sağladıkları için Dr. Lee Makowski'ye teşekkür ediyor. Yazar ayrıca Tetsuya Kawagoe'yi QCM deneyinin teknik yardımı için kabul ediyor. Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.) tarafından kısmen desteklendi.
VERI KULLANıLABILIRLIĞI BILDIRIMI
Tek başına RELIC programları ve ilaçlar için benzeşim tarafından seçilen peptitlerin sıra verileri ve bu makalede kullanılan proteom veritabanındaki protein dizileri talep üzerine bu yazardan edinilebilir (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

NOT: Aşağıda, bir QCM biyosensörü kullanarak uyuşturucu tanıyan T7 fajlarının taranıp E. coli (BLT5615) enfeksiyonu yoluyla taranan fajların kurtarılması için adımlar yer bunların altı çizilmiştir. Kendi kendine monte edilmiş bir monolayer (SAM) oluşturan küçük bir molekülün türevinin sentezi ve T7 fajla görüntülenen 15 mer rastgele peptit kütüphanesinin inşası için protokoller başka bir yerde bulunabilir6,7.
1. QCM sensör çipinin hazırlanması
<ol><li>27 MHz'lik bir QCM cihazının osilatörüne seramik bir sensör çipi takın ve küçük molekül hareketsizleştirmeden önce iç frekansı (Hz) hava fazına kaydedin.</li>
	<li>Çipi ayırın ve bir pipet kullanarak sensör çipinin altın elektrodu üzerine SAM oluşturan küçük bir molekül türevinin 20 μL çözeltisini (%70 etanolde 1 mM) bırakın. DİkKAT: Altın elektrodun (Au, 0,1 mm kalınlığında, 2,5 mm i.d., 4,9 mm2)bulunduğu sensör çip kristali son derece incedir ve kolayca çatlayabilir (SiO2, 0,06 mm kalınlığında, 9 mm i.d.). Bu nedenle, pipet dikkatlice.</li>
	<li>Nemlendirilmiş dokuya sahip ve oda ışıklarından korumalı bir Petri kabında oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) 1 saat bekletin.</li>
	<li>Elektrot yüzeyini ultra saf su ile hafifçe yıkayın; ardından, bir şırınna veya hava tozlayıcı ile hava üfleyerek su damlalarını çıkarın.</li>
	<li>QCM aparatı için sensör çipini kurun ve hareketsiz hale getirilen küçük molekülün miktarını ölçmek için hava fazında frekanstaki azalmayı kaydedin. NOT: Başarılı küçük molekül hareketsizleştirme için en az 100 Hz iç frekans gereklidir (1 Hz 30 pg'yi hareketsizleştirir).</li>
</ol>2. T7 faj kütüphanesinin QCM biyosensör kullanılarak biyopanningi (Şekil 1)
<ol><li>QCM biyosensörde özel bir manyetik karıştırıcı ile bir cuvette ayarlayın ve reaksiyon tamponunun 8 mL'lik kısmını (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) cuvette'e dökün.</li>
	<li>QCM sensör çipini osilatöre takın ve çipi 1000 rpm'de karıştırılan tampona batırmak için osilatörün kolunu aşağı çekin.</li>
	<li>Kişisel bilgisayarda (PC) QCM frekansını izlemeye başlayın ve sensorgram frekans kaymasının yaklaşık 3 Hz / dakikasına kadar eşdeğer olana kadar bekleyin.</li>
	<li>Cuvette'e 8 μL T7 faj kütüphanesi (1-2 ×10 10 pfu/mL) enjekte edin (son konsantrasyon: 1-2 ×10 7 pfu/mL) ve sensördeki enjeksiyon noktasını işaretleyin.</li>
	<li>T7 fajlarının altın elektrot yüzeyinde hareketsiz hale getirilen küçük moleküle bağlanmasının neden olduğu frekans azaltmayı 10 dakika boyunca izleyin.</li>
	<li>QCM frekans monitörünü durdurun, sensör çipini osilatörden çıkarın ve havayı üfleyerek ve/veya mendillerle fitilleyerek tamponu çıkarın.</li>
	<li>Sensör çipini nemli bir Petri kabına yerleştirin ve kütük fazındaki 1 mM'ye IPTG ekleyerek 37 °C'de sallayarak E. coli (BLT5615) (OD600 = 0.5—1.0) süspansiyonunun 20 μL'lik süspansiyonunu altın elektrot üzerine bırakın.</li>
	<li>Kabın kapağını kapatın ve ışığı engellemek için alüminyum folyo ile örtün.</li>
	<li>Bağlı T7 fajlarının geri kazanımını artırmak için kabı 96 kuyulu bir mikro plaka karıştırıcıda (1000-1500 rpm) 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Çözeltinin 20 μL'lik kısmını geri alın ve 200 μL LB ortasına askıya alın. NOT: Bu adımda elde edilen numuneler 4 °C'de bir hafta korunabilir.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarında açıklanan genel prosedüre göre plak izolasyonu ve DNA dizilimi için faj çözeltisinin bir seyreltme serisini hazırlayın8,9.</li>
	<li>Altın elektrot yüzeyini% 1 sodyum dodecyl sülfat çözeltisi ile ıslatılmış bir pamuklu çubukla silin.</li>
	<li>Altın yüzeyi yıkama şişesinden ultra saf su ile yıkayın ve ardından bir şırınna veya hava tozlayıcı ile hava üfleyerek su damlalarını çıkarın.</li>
	<li>Altın yüzeye 5 μL piranha çözeltisi (Conc. H2SO4: %30 H2O2 = 3:1) bırakın ve 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Altın yüzeyi tekrar suyla yıkayın ve ardından hava üfleyerek ve/veya mendillerle fitilleyerek kurulayın.</li>
	<li>2.14 ve 2.15. DİkKAT: Piranha çözeltisini kullanmadan hemen önce hazırlayın. Çok güçlü bir asit olduğu için bu sıvıyı dikkatli kullanın. 5 dakikadan uzun süre tedavi sensör çipini aşındırır.</li>
</ol>3. Reseptör Ligand Contact (RELIC) program paketi kullanılarak biyoinformatik analizi (Şekil 2)10,11
<ol><li>MS Windows işletim sistemine sahip bir bilgisayarda tek başına RELIC programını açın.</li>
	<li>İlacı kullanarak seçilen veya her metin formatı dosyasındaki (ad.txt) ekransız üst kitaplıktan rastgele seçilen 15 mer peptit benzeşiminin amino asit dizilerini hizalayın.</li>
	<li>Fasta formatında her metin dosyasına tek veya birden çok proteinin amino asit dizisini yazın veya veritabanı metin dosyalarını fasta formatında herhangi bir protein veritabanından (örneğin UniProt (http://www.uniprot.org/) veya DrugBank (https://www.drugbank.ca/) indirin.</li>
	<li>Metin dosyalarını (ve HETEROalign için PDB dosyalarını) her RELIC programını çalıştırmak için gerekli klasöre yerleştirin.</li>
	<li>FTN95'in Kişisel Sürümünü açmak için bağımsız klasörde AADIV, BİlGİ, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon ve FASTAskan için yürütülebilir dosyayı (program.exe) tıklatın.</li>
	<li>Her programı yürütmek ve gerekli metin biçimi dosyasını edinmek için komut iletisine uzantı (ad.txt) ile birlikte uygun dosya adını yazın.</li>
	<li>Blosum62 (MATCH, HETEROalign) kullanılarak hesaplanan bilgi içeriği (INFO) veya kümülatif benzerlik puanlarının bir grafiğini oluşturmak için elde ettiği metin dosyasını bir elektronik tablo yazılımına (örneğin, Excel) verin. NOT: Özgün RELIC sunucusu (http://relic.bio.anl.gov) artık kullanılamıyor ve Windows platformuna sahip bilgisayarlarda çalışan bazı bağımsız türde RELIC programları ilgili yazardan (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp) edinilebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. M., Karuso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+cellular+targets+of+natural+products+using+T7+phage+display.">Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology+for+target+determination+of+small-molecule+therapeutics:+an+update.">Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phage+display+technology+for+the+determination+of+the+targets+for+small-molecule+therapeutics.">Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+QCM+Biosensor-Based+T7+Phage+Display+Combined+with+Bioinformatics+Analysis+for+Target+Identification+of+Bioactive+Small+Molecule.">Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule.</a> Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+disordered+portion+of+the+Brz2001-binding+site+on+a+plant+monooxygenase,+DWARF4,+using+a+quartz-crystal+microbalance+biosensor-based+T7+phage+display.">Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display.</a> ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+Select&#174;+System+Manual.">T7 Select&#174; System Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrientExpressTM+cDNA+Manual.">OrientExpressTM cDNA Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELIC--a+bioinformatics+server+for+combinatorial+peptide+analysis+and+identification+of+protein-ligand+interaction+sites.">RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites.</a> Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).</li><li>Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).</li><li>Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+the+clinical+experience,+pharmacology,+and+continued+development+of+the+camptothecins.">Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).</li><li>Harel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+complex+of+the+anticancer+prodrug+7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin+(CPT-11)+with+Torpedo+californica+acetylcholinesterase+provides+a+molecular+explanation+for+its+cholinergic+action.">The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action.</a> Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).</li><li>Dodds, H. M., Rivory, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+the+inhibition+of+acetylcholinesterases+by+irinotecan+(CPT-11).">The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11).</a> Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).</li><li>Bencharit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+CPT-11+activation+by+mammalian+carboxylesterases.">Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases.</a> Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).</li><li>Kim, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+neuraminidase+inhibitors+possessing+a+novel+hydrophobic+interaction+in+the+enzyme+active+site:+design,+synthesis,+and+structural+analysis+of+carbocyclic+sialic+acid+analogues+with+potent+anti-influenza+activity.">Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).</li><li>Hoffmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+pharmacokinetics+of+oseltamivir+and+oseltamivir+carboxylate+in+the+central+nervous+system.">Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DrugBank+5.0:+a+major+update+to+the+DrugBank+database+for+2018.">DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).</li><li>Takakusagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+biopanning+of+T7+phage-displayed+peptides+reveals+angiomotin+as+a+potential+receptor+of+the+anti-angiogenic+macrolide+Roxithromycin.">Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-cycle+affinity+selection+of+binding+proteins+or+peptides+specific+for+a+small-molecule+using+a+T7+phage+display+pool.">Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).</li><li>Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayer+(SAM)+of+small+organic+molecule+for+efficient+random-peptide+phage+display+selection+using+a+cuvette+type+quartz-crystal+micobalance+(QCM)+device.">Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device.</a> World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).</li><li>Kusayanagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+agent+doxorubicin+binds+to+Fanconi+anemia+group+F+protein.">The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+C10+biotinylated+camptothecin+(CPT-10-B)+binding+peptides+using+T7+phage+display+screen+on+a+QCM+device.">Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).</li><li>Rodi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecule+binding+sites+within+proteins+using+phage+display+technology.">Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).</li></ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Burada, ilaç tanıyan peptitlerin QCM biyosensör bazlı biyopannlaması için bir strateji ve ardından tanımlanan peptitleri kullanarak ilaç-protein etkileşimlerini doğrulamak için biyoinformatik analizi sunulmuştur. Biyosensörün altın elektrodu üzerinde hareketsizleştirme için küçük molekül türevlerinin tasarlanması önemli bir adımdır, çünkü tanıtılan bağlayıcı ilacı tanıyan peptitin bağlanmasını ve toplanmasını engelleyebilir. Bunu önlemek için, tanıtılan bağlayıcının farklı pozisyonlarına sahip türevler hazırlanır23. Alternatif olarak, hidrofobik küçük molekülleri hareketsiz hale getirmek için, sensör çipi 10 cm Petri kabında dökme suya batırılır ve küçük molekülün 20 μL çözeltisi (dimetil sülfitte 10 mM çözeltisi) biyosensörün altın elektroduna, yüzeyini örtmek için bırakılır ve 5 dakika boyunca inkübe edilir. Bu, biyopannlama sırasında en az 10 dakika tutulan küçük moleküllerin yüz altı hertz iç frekansının tutulmasına izin verir. Gerçekten de, bu tür hareketsizleştirmeyi kullanarak, Osel benzeşimi tarafından seçilen peptitler, NA'daki Osel bağlama bölgesini açıkça vurgulamıştır (Şekil 3).
Buradaki peptit kütüphanesini hazırlamak için kullanılan T7 fajı, standart amino asitlerin 20'si için 32 kodon kodlayan ve 2 stop kodonunun (UAA, UGA) ortaya çıkışını bastıran ve sadece UAG ( Şekil 1 ) 6,7ortaya çıkan NNK15kaseti kullanılarak genetik olarak tasarlanmıştır. Bu, 15 mer tam boy peptitlerin görüntülenmesi ve kütüphanenin çeşitliliğinin artırılması için önemlidir. T7 fajlı ekran sistemi 107 —109 T7 fajlık teknik ekran sınırına sahiptir. Bununla birlikte, 15-mer peptit kütüphanesinin çeşitliliği teorik olarak 2015 'tir (3.27 × 1019); bu nedenle, tam kütüphane yapımı için kullanılamaz. Bununla birlikte, korunmuş motiflerin benzerlik araması veya madenciliği, kütüphanedeki bu sınırlı peptit çeşitliliği ile bile proteinlerin ilaç bağlama alanlarını oluşturan amino asitlerin tespit edilmesine izin verir. Ek olarak, kütüphane peptidi içinde 3-5 amino asit uzanır (görünüm oranı T7 faj görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilen 1/203 ile1/ 20 5arasındadır) küçük moleküllü ilaçların tanınmasında rol oynar; bu nedenle, peptit dizilerinin hedef proteinin ilaç bağlama bölgesini oluşturan 15-mer amino asit dizileri ile% 100 eşleşmesi gerekli değildir. Gerçekten de, yaklaşık 30 benzeşim seçilmiş peptit, test edilen her ilaç için hedef proteinin bağlama bölgesini başarıyla vurgulamıştır (Şekil 4). Böylece, kullanılan ana T7 faj kütüphanesinin çeşitliliği (1.7 × 107 pfu/mL) ilaç bağlama bölgesini sezgisel olarak yeniden oluşturmak için kullanılabilir.
Tipik olarak, T7 fajlarının 3-5 kopyası, ilaç tanıyan amino asit esnemelerini barındıran 15-mer amino asit dizilerinin dizileriyle aynı dizileri gösteren, keyfi olarak izole edilen 16 plak içinde ortaya çıktı ve bu da protokolümüz kapsamındaki benzeşim seçiminin başarısını gösterdi. Bu, izole edilen 96 plakta (sayı mikro plaka formatı ile ilişkilidir) 18-30 farklı ilaç tanıyan peptit dizisinin toplandığını ve daha sonra DNA'nın dizilimi kullanılarak ve ilgili amino asit dizisinin elde edildiğini gösterir. Mevcut stratejide, T7 faj kütüphanesinin 8 μL'lik kısmının 8 mL tampon (kütüphanenin 1000 kat seyreltilmesi) içeren cuvette'e enjektesi, T7 fajlarının spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için uygundur. Benzeşim tarafından seçilen peptitlerin çeşitliliğini artırmak için, bir döngü seçimini birkaç kez tekrarlamak ve tarama başına 16 veya 32 plak izolasyonu kullanmak, aynı anda tek bir çözeltiden izolasyondan daha etkili olduğunu kanıtladı. Örneğin, yaklaşık 30 farklı sıralı benzeşim seçilmiş peptitleri etkili bir şekilde toplamak için, 3-6 set tek döngülü seçim yapıldı, her deneyde 16 veya 32 plak izole edildi. 16 veya 32 T7 faj plaklarının hepsinde aynı dizilerin ortaya çıkması, arka planın yanlışlıkla tespit edildiği veya taşıma olarak kontaminasyon olabileceği belirtilmektedir. Buna karşılık, 15 mer uzunluğundan daha kısa peptitlere sahip birçok T7 fajının aynı dizilimi veya görünümüne sahip T7 fajlarının bulunmaması, popülasyondaki T7 fajlarının özellikle yüksek olasılıkla ortaya çıktığını göstermektedir. QCM frekans azalması bu gibi durumlarda bile aynı ölçüde gerçekleştiğinden, seçimin başarısı izole T7 fajının DNA'sı sıralanarak kapsamlı bir şekilde değerlendirilmeli ve ardından peptitlerin amino asit dizilerinin biyoinformatik analizi yapılmalıdır. Ayrıca, geleneksel T7 faj ekran protokolünden farklı olarak, T7 fajlarının varyasyonu ve sayısı küçük olduğundan ve amplifikasyon ve seçim adımlarını tekrarladıktan sonra bile konsantre olmadığı için seçim turlarının tekrarlanması daha az etkilidir23.
Daha da önemlisi, bu yöntem insanların, patojenik virüslerin ve hatta bitkilerin proteomlarında küçük molekül bağlayıcı bölgelerin madenciliği için geçerlidir. İlginçtir ki, T7 faj kapsid üzerindeki peptitlerin muhtemelen yapılandırılmamış kısa ekran uzunluğu, küçük bir molekülle kenetlenme sırasında protein peptitlerinin moleküler dinamiklerini taklit edebilir; bu dinamik bağlamayı yansıtabilir24. Geleneksel yöntemlerin teknik sınırlamalarının ötesinde, küçük moleküller için aynı protokoller için geçerli olan bu strateji, ilaçlanabilir proteomu genişletebilir ve ilaç-protein etkileşim analizi ile ilgili daha ayrıntılılık sağlayabilir.
Bu yaklaşımın bazı teknik sınırlamaları göz önünde bulundurulmalıdır. Biyosensör çipinin altın elektrot yüzeyinde küçük molekül hareketsizleştirme için organik sentez gereklidir. Organik kimya uzmanı olmayanlar için, bazı hareketsizleştirme reaktifleri, küçük molekülü kaplinle mekanik olarak sabitlemek için ticari olarak mevcuttur. Ayrıca, peptitlerin bazı saçma kısımları, ilacın kenetlenmeyle ilgili olmayan proteinin bir kısmının yanlış pozitif olarak tespit edilmesine neden olabilir. Bu, T7 fajının kopyaları üretildiğinde, diğer standart amino asitlerden daha fazla kodon tarafından kodlanan lösin veya valin kalıntıları bakımından zengin beta-tabaka veya lösin bakımından zengin alanlara ampirik olarak karşılık gelir. Kitaplık peptit uzunluğunun kontrol altına alındırıcısı yanlış pozitiflerin oluşumunu kontrol edebilir. Buna karşılık, X-ışını kristalografisi veya NMR analizi kullanılarak gösterildiği gibi, kenetlenmede rol oynayan ilaç bağlama bölgesinde amino asit kalıntılarının tespit edilmediği durumlar olabilir. Bu, ilaç tanıyan peptitlerin daha fazla sayıda toplanması veya altın elektrot üzerindeki küçük moleküllerin sabitleme yönünün değiştirilmesiyle çözülebilir.
İlaç kullanımının ana ve ikincil etkileri ile ilgili birçok ilaç-protein etkileşimi henüz proteomda tanımlanamayabilir; ek olarak, ilaç emilimi, dağılımı, metabolizması, atılımı ve toksisiteden sorumlu enzimler ve taşıyıcılar da hala tanımlanamayabilir. Protein bağlama her zaman bir ilacın biyoaktivitesi için sorumlu değildir. Bu nedenle, biyolojik tahlillerden elde edilen diğer bilgilerin bir kombinasyonu, ilaçların ana ve olumsuz etkilerinden sorumlu temel ilaç hedeflerinin tanımlanmasını geliştirecektir. Bu özlü tekniğin daha fazla adaptasyonu, çok çeşitli küçük moleküllü ilaçların protein bağlayıcı alanlarının madenciliği için pratikliği ve verimi artıracaktır. Burada sunulan yöntem, sadece ilgili alanlarda temel araştırmaların yapılmasına değil, aynı zamanda klinik kullanımda ilaçların terapötik etkinliğinin veya diğer biyolojik etkilerinin altında kalan moleküler mekanizmaların açıklığa kavuşturulmasına da büyük ölçüde katkıda bulunacaktır.

İlaç bağlayıcı hedeflerin belirlenmesi, ilaçların geliştirilmesinin yanı sıra hastalıkların moleküler mekanizmalarının anlaşılması için de gereklidir. Özellikle, reseptör ve enzim proteinleri biyoaktif küçük moleküllerin en önemli moleküler hedefleridir1. Benzeşim yakalama, ilaç bağlayıcı proteinleri tanımlamak için iyi kurulmuş bir teknik olmasına rağmen2, proteinlerin düşük çözünürlüğü gibi teknik sınırlamalar, genellikle ilaç hedeflerinin doğrulanmasını engeller2. En önemlisi, hareketsiz küçük moleküller kenetlenme için gerekli özgürlük derecesini kaybeder ve daha büyük hedef proteinler üzerinde dahili olarak bulunan bağlama bölgelerine erişilemez olabilir. Ayrıca, protein yanlış katlanması, ko-kristalizasyon koşullarının analiz edilemezliği ve moleküler boyuta bağlı sınırlamalar genellikle X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve ilaç-protein etkileşimlerini incelemek için diğer deneysel analizlerin kullanımını engeller.
T7 faj ekran biyopanning kullanımı, küçük molekül yemleri için proteinler üzerindeki bağlama bölgesini belirlemek için etkili bir yoldur3. Özellikle, sentetik DNA'nın çoklu klonlama bölgesine yerleştirilmesiyle oluşturulabilen T7 fajlı rastgele peptit kütüphanesi etkilidir. Proteinleri görüntüleyen T7 faj kütüphanesi ile karşılaştırıldığında, kısa peptitler fiziksel kısıtlamalar olmadan T7 faj kapsidinde görüntülenecek şekilde kolayca tasarlanmıştır, bu da katı bir destek üzerine sabitlenmiş herhangi bir küçük molekül ilacı ile sterik olarak temas edebilir2. Ayrıca, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörün T7 faj ekran biyopanning platformunagirmesi,QCM frekansındaki azalmayı izleyerek kısa peptitlerin ilaçlarla zayıf ama spesifik etkileşimlerinin tanımlanmasını sağlar4,5. Bağlı T7 fajı daha sonra konak Escherichia coli (BLT5615) enfekte edilerek doğrudan iyileşir ve uyuşturucu tanıyan kısa segmentleri barındıran benzeşim tarafından seçilen peptidi kodlayan bölgenin DNA dizisi belirlenir. Peptit popülasyonunun amino asit dizisinin daha sonraki analizi ilaç tanıma hakkında bilgi sağlar. Kurtarılan amino asit dizilerinin siliko çift yönlü hizalamasında, seçilen bir proteom içinde ilacın biyolojik hedefi hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir. Bir ilaca yakınlığı olan protein parçalarının bu yüksek verim tanımlaması, ilaç bağlama bölgesini, çömlek parçalarından eski bir eserin yeniden inşasına benzer bir şekilde sezgisel olarak yeniden oluşturmak için kullanılabilir6. Özellikle, geleneksel proteomik yaklaşımlar başarısız olduğunda bu benzersiz yaklaşım yararlı olabilir.
Burada, T7 fajla görüntülenen peptitlerin biyopanningi için biyosensör tabanlı bir strateji ve küçük moleküllerin hedef doğrulaması için biyoinformatik analizi sunuyoruz. Geleneksel yöntemlerdeki teknik sınırlamaların ötesinde, bu strateji, aynı protokol kapsamında herhangi bir küçük ilgi molekülü için hedef proteinlerdeki ilaç bağlayıcı bölgelerin tanımlanmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>AFFINIXQ&lt;sub&gt;N&lt;/sub&gt;</td><td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td><td>QCM2008-STKIT</td><td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AADIV</td><td>Northeastern University&lt;br/&gt; (Lee Makowski)</td><td>AADIV.exe</td><td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td></tr><tr><td>Ceramic Sensor Chip</td><td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td><td>QCMST27C</td><td>4 sensor chips/package</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich&lt;br/&gt; (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td><td>09-0850</td><td></td></tr><tr><td>FASTAcon</td><td>Northeastern University&lt;br/&gt; (Lee Makowski)</td><td>FASTAcon.exe</td><td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td></tr><tr><td>FASTAskan</td><td>Northeastern University&lt;br/&gt; (Lee Makowski)</td><td>FASTAskan.exe</td><td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td></tr><tr><td>Immiblization kit for AFFINIX</td><td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td><td>QCMIMKT</td><td>SAM reagent and amine coupling reagent</td></tr><tr><td>INFO</td><td>Northeastern University&lt;br/&gt; (Lee Makowski)</td><td>INFO.exe</td><td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td></tr><tr><td>Liquid LB medium</td><td>Sigma-Aldrich&lt;br/&gt; (St. Louis, MO, USA)</td><td>L3522</td><td>Autoclave for 20 min</td></tr><tr><td>MATCH</td><td>Northeastern University&lt;br/&gt; (Lee Makowski)</td><td>MATCH.exe</td><td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&amp;ndash;6 amino acids in length).</td></tr><tr><td>MOTIF1</td><td>Northeastern University&lt;br/&gt; (Lee Makowski)</td><td>MOTIF1.exe</td><td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td></tr><tr><td>MOTIF2</td><td>Northeastern University&lt;br/&gt; (Lee Makowski)</td><td>MOTIF2.exe</td><td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Receptor ligand contacts (RELIC)</td><td>Argonne National Laboratory&lt;br/&gt; (Lemont, IL, USA)</td><td>https://www.relic.anl.gov</td><td>Currently unavailable&lt;br/&gt; (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td><td>252859</td><td></td></tr></tbody></table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

Reseptörler ve enzim proteinleri, biyoaktif küçük moleküller için bağlayıcı hedefler görevi gören önemli biyomoleküllerdir. Bu nedenle, ilaç-protein etkileşimlerinin hızlı ve küresel olarak doğrulanması, sadece terapötik etkinliğin altında kalan moleküler mekanizmaları anlamak için değil, aynı zamanda klinik kullanım için adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, atılım ve toksisite (ADMET) gibi ilaç özelliklerini değerlendirmek için de son derece arzu edilir. Burada, faj kapsid üzerinde kolayca görüntülenebilen T7 faj ekranlı kısa peptitlerin biyopanlanması için biyosensör tabanlı yüksek verim stratejisi sunuyoruz. Reseptör ligand contact (RELIC) süitinde biyoinformatik programları kullanan ilaç bağlayıcı bölgelerin "kırık kalıntılar" olarak kısa segmentler içeren peptitlerin amino asit dizilerinin daha sonra analizi de gösterilmiştir. Bu yöntem klinik olarak onaylanmış iki ilaca, bir anti-tümör irinotecan'a ve bir anti-grip oseltamivirine uygulanarak, ilacı tanıyan peptit dizilerinin toplanması ve hedef proteinlerin ilaç bağlayıcı bölgelerinin vurgulanması için ayrıntılı süreç bu makalede açıklanmıştır. Burada açıklanan strateji, ilgi çekici herhangi bir küçük molekül için uygulanabilir.

Klinik olarak onaylanmış iki ilacın temsili sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. İlerlemiş kolorektal kanser ve küçük hücreli dışı akciğer kanserinin tedavisinde kullanılan doğal camptothecin'in suda çözünen bir prodrugu olan Irinotecan (Şekil 3A),kanser hücrelerinde topoisomeraz I'yi inhibe eden karaciğerde SN-38'e dönüştürülür12. Ayrıca, bu bileşik doğrudan asetilkolinsteraz (AChE)13,14inhibe eder. Strateji sayesinde, Iri'yi SAM olarak hareketsiz olarak tanıyan 29 peptit, QCM biyosensör tabanlı tek döngülü biyopannlama alt kümeleri tarafından tanımlandı. 29 peptit ve AChE'nin sonraki çift yönlü hizalaması Y121, Q225, F290, E327, H440 ve Y442 için maksimum puanlar verdi ve üç boyutlu yapıdaki kısmı vurguladı. Bu amino asit kalıntıları, AChE'nin Iri bağlayıcı bölgesini oluşturanlarla tutarlıydı. Aynı peptit alt kümesi E99'u başarıyla tanımladı, L100, L252, L305, I387 ve V474 katalitik üçlü (S221, E353 ve H467) karboksisteraz (CE) civarında, bu amino asitlerin Iri15'inesterifikasyonu sırasında Iri tanıma için bir iskele oluşturduğunu gösterir. Katalitik bölgede bulunan bu tür amino asit kalıntıları, enzim reaksiyonu sorunsuz ilerledikçe ve genel deneysel koşullar altında statik kompleksi kesin olarak oluşturmadığı için geleneksel X-ışını kristalografisi veya NMR analizi kullanılarak doğrudan tanımlanamaz. Bu nedenle, belirli bir ilaç için metabolik reaksiyonlar sırasında enzimlerle oluşturulan ara komplekslerdekiler de dahil olmak üzere birden fazla proteinin ilaç bağlayıcı bölgelerinin kombinatoryal tespiti, bir ilaç için belirlenen benzeşim tarafından seçilen peptitler kullanılarak mümkündür.
Şekil 3B, influenza virüsünün neuraminidazını (NA) inhibe eden oseltamivir karboksilat için aktive edilen bir grip önleyici ilaç olan oseltamivir (Osel) için elde edilen diğer sonuçları göstermektedir16. QCM sensör çipi altın elektrot yüzeyini kaplayan Osel'i tanıyan peptitlerin 27'si, NA16'dakiOsel bağlama bölgesini başarıyla tespit etti. Bu bağlama bölgesi, Osel ile kenetlenirken dinamik hareketten geçme potansiyeli olan yapılandırılmamış peptit döngülerinden oluşur. T7 faj kapsid üzerindeki Osel tanıyan peptitler, QCM sensör çipinin altın elektrot yüzeyine sabitlenmiş Osel'e bağlanırken bu dinamik yerleştirmeyi taklit edebilir. Gripli genç hastalarda nöropsikiyatrik advers olaylar (NPAE' ler) tanımlanmıştır, bu da hastalar üzerindeki etkisi muhtemelen ilaçtan ziyade hastalığın kendisiyle ilgilidir. Çalışmalar, Osel'in kemirgenlerin merkezi sinir sisteminden (CNS) kan-beyin bariyerinde (BBB) multidrug direnci (MDR) proteini yoluyla aktif olarak ihraç edildiğini göstermiştir17. Gerçekten de, bu MDR sınıfının proteinlerinden biri, çalışmamızda diğer ışınlayıcılara, nörotransmitterle ilgili enzimlere ve reseptörlere ek olarak yüksek bir puan (DrugBank 1.0 protein veritabanında4.396'danen iyi% 5) gösterdi. Bu proteinlerin Osel'in yan etkilerinin ortaya çıkması açısından farmakolojik önemi araştırılmaktadır.
Şimdiye kadar, hedef proteinlerdeki tek ve çoklu küçük molekül bağlama bölgeleri, stratejimizi kullanan altı küçük molekül ilacı için başarıyla tanımlanmıştır (Şekil 4). Brz2001 ve roxithromycin (RXM) için, bir hedef protein üzerindeki özdeş ilaç bağlama bölgeleri, sayıları ve amino asit dizileri tamamen7,19değişen farklı peptit havuzları kullanılarak tanımlanmıştır. Ayrıca, Iri, RXM ve Osel için elde edilen tek peptit havuzları, her ilaç için AChE ve CE for Iri (Şekil 3A) 20 , anjiyomotin ve RXM19,21için CYP3A4 ve Osel için NA ve MDR ilişkili protein gibi farklı proteinler üzerinde birden fazla bağlayıcı bölgenin tanımlanmasına yol açmıştır. Anti-tümör bileşik doxorubicin (FANCF)22ve anti-anjiyojenik makrolid antibiyotik RXM (anjiyomotin)19için bilinmeyen bir moleküler hedef tanımlanmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> Şekil 1: T7 fajla görüntülenen peptit kütüphanesinin QCM biyosensör bazlı biyopanninginin şematik gösterimi. Rastgele peptitleri görüntüleyen bir T7 faj kütüphanesi, QCM biyosensör çipinin batırıldığı ve frekansın stabilize edildiği tamponu (karıştırma altında) içeren cuvette enjekte edilir. T7 fajlarının sensör çipinin altın elektrot yüzeyinde hareketsiz hale getirilen küçük moleküllere bağlanması nedeniyle frekans azaltmayı izledikten sonra sensör çipi osilatörden ayrılır. Bağlı T7 fajından DNA daha sonra konak E. coli (BLT5615) enfeksiyonundan sonra doğrudan iyileşir. Elde edilen T7 fajları plak oluşumu ile izole edilir ve son olarak T7 faj kapsidinde görüntülenen ilaç benzeşimi seçilen peptitin amino asit dizisi genel faj görüntüleme yöntemine göre belirlenir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> Şekil 2: İlaçla seçilmiş peptitler ile tek veya çoklu proteinler arasındaki dizi karşılaştırmasının nicel değerlendirmesinin şematik gösterimi. İlaçla seçilen peptit dizileri sırasıyla tek ve çoklu proteinlerin birincil amino asit dizileri ile hizalanır ve her 3-5 amino asit kümesindeki benzerlik, değiştirilmiş bir BLOSUM62 matrisine göre çift yönlü hizalama ile kümülatif olarak puanlanır. Ortaya çıkan arsa veya diyagram, protein üzerinde potansiyel bir ilaç bağlama bölgesi oluşturan kalıntıları veya bölümleri gösterir. Uygun bir RELIC programı kullanarak daha fazla analiz, üç boyutlu yapıdaki bağlama sitesini vurgular (PDB dosyası varsa) veya muhtemelen bağlama hedefi olan tüm proteinleri sıralar (HETEROalign programı şu anda kullanılamıyor). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> Şekil 3:Peptit toplama ve sonraki biyoinformatik analizinin temsili sonuçları. (A) Irinotecan (anti-tümör prodrug, topoisomeraz I inhibitörü). T7 faj etkileşimi QCM frekansında azalma olarak 10 dakika izlendi. Bağlı T7 fajının DNA'sı ele geçirildi ve karşılık gelen amino asit dizisini belirlemek için sıralandı. Tek döngülü biyopannlamanın bir alt kümesi kullanılarak toplanan 29 adet 15 mer peptidden oluşan amino asit dizileri, AChE'nin Iri bağlayıcı bölgesini oluşturan amino asitleri vurgulamıştır [PDB ID 1U65]. Aynı 29 peptit kullanılarak yapılan daha fazla değerlendirmede, Iri'yi SN-38'e (aktif form) dönüştüren bir karaciğer enzimi olan CE'deki katalitik triyad'ın komşu amino asit kalıntıları (de-esterifikasyon için iskele kalıntıları) vurgulandı [PDB ID: 1K4Y]. Taranmamış üst kütüphane7,19'dan rastgele seçilen103 peptitin benzerlik puanları, kütüphane önyargısını ortadan kaldırmak için bu puanlardan çıkarıldı. Bu rakamlar Elsevier'in izniyle Ref. 20'den çoğaltılır. (B) Oseltamivir (grip önleyici ilaç). Osel tanıyıcı amino asitler içeren 27 peptit, neuraminidaz (NA) (virüs enzimi) için Osel bağlayıcı bölgenin düzensiz kısımlarını vurguladı [PDB Kimliği: 2HT7]. DrugBank 1.018'deki 27 peptit ve 4.396 protein arasındaki dizi benzerliğinin küresel olarak doğrulanması, NA'nın merkezi sinir sisteminin işlevleriyle ilişkili konak insan proteinlerine ek olarak ilk% 5 aralığında olduğunu ortaya koydu. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> Şekil 4:Bağlama hedefleri bustrateji kullanılarak tanımlanan küçük moleküllerin özeti. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions at JoVE.com

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

biosensor-based-high-throughput-biopanning-bioinformatics-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.9K Görüntüleme.  National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology. Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

Video: Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Biyokimya

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. Biomolecules such as proteins, carbohydrates, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and enzymes are fundamental building blocks of living beings; they assemble into complex networks in biosystems to synchronize a myriad of life events. Proteins typically utilize complex interactome networks to carry out their functions; hence it is mandatory to evaluate such interactions to unravel their importance in cells at both cellular and organism levels. Toward this goal, we introduce a rapidly emerging technology, field-effect biosensing (FEB), to determine specific biomolecular interactions. FEB is a benchtop, label-free, and reliable biomolecular detection technique to determine specific interactions and uses high-quality electronic-based biosensors. The FEB technology can monitor interactions in the nanomolar range due to the biocompatible nanomaterials used on its biosensor surface. As a proof of concept, the protein-protein interaction (PPI) between heat shock protein 90 (Hsp90) and cell division cycle 37 (Cdc37) was elucidated. Hsp90 is an ATP-dependent molecular chaperone that plays an essential role in the folding, stability, maturation, and quality control of many proteins, thereby regulating multiple vital cellular functions. Cdc37 is regarded as a protein kinase-specific molecular chaperone, as it specifically recognizes and recruits protein kinases to Hsp90 to regulate their downstream signal transduction pathways. As such, Cdc37 is considered a co-chaperone of Hsp90. The chaperone-kinase pathway (Hsp90/Cdc37 complex) is hyper-activated in multiple malignancies promoting cellular growth; therefore, it is a potential target for cancer therapy. The present study demonstrates the efficiency of FEB technology using the Hsp90/Cdc37 model system. FEB detected a strong PPI between the two proteins (KD values of 0.014 &#181;M, 0.053 &#181;M, and 0.072 &#181;M in three independent experiments). In summary, FEB is a label-free and cost-effective PPI detection platform, which offers fast and accurate measurements.

Field-effect biosensing (FEB) is a label-free technique for detecting biomolecular interactions. It measures the electric current through the graphene biosensor to which the binding targets are immobilized. The FEB technology was used to evaluate biomolecular interactions between Hsp90 and Cdc37 and a strong interaction between the two proteins was detected.

Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Biyoloji

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Yüksek Verimli İlaç Taraması için Transkriptom Profili Oluşturma

Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening

Transcriptomics allows&#160;to obtain comprehensive insights into cellular programs and their responses to perturbations. Despite a significant decrease in the costs of library production and sequencing in the last decade, applying these technologies at the scale necessary for drug screening remains prohibitively expensive, obstructing the immense potential of these methods. Our study presents a cost-effective system for transcriptome-based drug screening, combining miniaturized perturbation cultures with mini-bulk transcriptomics. The optimized mini-bulk protocol provides informative biological signals at cost-effective sequencing depth, enabling extensive screening of known drugs and new molecules. Depending on the chosen treatment and incubation time, this protocol will result in sequencing libraries within approximately 2 days. Due to several stopping points within this protocol, the library preparation, as well as the sequencing, can be performed time-independently. Processing simultaneously a high number of samples is possible; measurement of up to 384 samples was tested without loss of data quality. There are also no known limitations to the number of conditions and/or drugs, despite considering variability in optimal drug incubation times.

Yazar Gündemi: Uygun Maliyetli Transkriptomik İlaç Taraması - Yeni Hedeflerin Kilidini Açmak 

This protocol describes a workflow from ex vivo or in vitro cell cultures to transcriptomic data pre-processing for cost-effective transcriptome-based drug screening.

Uygun Maliyetli Transkriptomik Tabanlı İlaç Taraması

Transcriptomics allows&#160;to obtain comprehensive insights into cellular programs and their responses to perturbations. Despite a significant decrease ...

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Uygun Maliyetli Transkriptomik Tabanlı İlaç Taraması

Uygun Maliyetli Transkriptomik Tabanlı İlaç Taraması

Uygun Maliyetli Transkriptomik Tabanlı İlaç Taraması