BSA antijen jelleri, mevcut kontrolleri tamamlayabilen, iyi karakterize edilmiş tekrarlanabilir IHC standartlarıdır. Bu protokol, bilinen bileşimin tekrarlanabilir standartlarını yapmak için standart histoloji ve IHC reaktiflerini ve yöntemlerini kullanır. Bu kontroller, farklı laboratuvarların tanısal olarak ilgili birçok tahlil için IHC tahlillerini kalibre etme ve standartlaştırma fırsatı sağlar.
Peptit veya proteini çözmek için uygun bir çözücü bulmak önemlidir. Antijen ve formaldehit çözeltilerini kabarcıklar sokmadan hızlı bir şekilde karıştırmak zor olabilir. Başlamak için, 14 mililitre PBS içinde, eşit olarak dağılana kadar 50 mililitrelik bir konik tüp içinde beş gram BSA tozunu karıştırarak, hacimce% 25 ağırlığında 20 mililitre BSA çözeltisi hazırlayın.
BSA tozunu çözmek için çözeltiyi vorteksleyin. Tamamen çözünme için çözeltiyi gece boyunca dört santigrat derecede tutun. Ertesi gün, PBS ile son ses seviyesini 20 mililitreye ayarlayın.
Benzer şekilde, 13 mililitre PBS içinde 6.26 gram BSA tozunu karıştırarak hacimce% 31.3 ağırlığında 20 mililitre BSA çözeltisi hazırlayın. Tam çözünme için gece boyunca inkübasyondan sonra, PBS ile son hacmi 20 mililitreye ayarlayın. BSA formaldehit karışımının bir jel oluşturduğunu test etmek için, bir ısı bloğunu 85 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.
Daha sonra% 25 BSA çözeltisinin 700 mikrolitresini% 700 mikrolitre% 37 formaldehit ile karıştırın. Hava kabarcıkları oluşturmadan beş ila 10 saniye içinde beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın. Karıştırmadan hemen sonra, kapalı mikro santrifüj tüpünü 85 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış ısı bloğuna yerleştirin.
10 dakika sonra, tüpü ısı bloğundan çıkarın. Soğumasına izin verin ve jelin beklendiği gibi oluştuğunu onaylayın. Sekiz adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü hazırlayın ve açıkça etiketleyin.
Daha sonra 5x peptid stok çözeltisi hazırlayın, serbestleştirilmiş peptidin tüm kütlesini uygun çözücünün 60 mikrolitresinde yeniden askıya alarak 12.5 milimolar konsantrasyon ekleyin. Peptitin tamamen çözündüğünden emin olmak için çözeltiyi gözlemleyin. Daha sonra, peptitlerin moleküler ağırlığına, kütlesine ve saflığına göre 12.5 milimolar bir çözelti yapmak için gerektiğinde ek bir çözücü hacmi ekleyin.
Bu örnekte, 5x peptid stoğu 626.9 mikrolitrelik bir son hacme sahiptir. Diğer peptit örnekleri farklı bir son hacim gerektirecektir. Daha sonra, 150 mikrolitre 1x peptid stok çözeltisi hazırlayın, 5x peptid stoğunun 30 mikrolitresini çözücünün 120 mikrolitresine seyrelterek 2.5 milimolar konsantrasyon ekleyin.
Çözeltiyi beş saniye boyunca vorteksleyin ve oda sıcaklığında santrifüj yapın. Daha sonra, 1x peptid stoğunun 140 mikrolitresini% 31.3 BSA çözeltisinin 560 mikrolitresine seyrelterek 700 mikrolitre 0.5 milimolar peptid BSA çözeltisi hazırlayın. Vorteksten sonra, çözeltiyi oda sıcaklığında santrifüj edin.
Benzer şekilde,% 25 BSA çözeltisinin 630 mikrolitresine 70 mikrolitre peptit BSA çözeltisi ekleyerek peptid BSA stoğunun dört ardışık 10x seri seyreltilmesini hazırlayın. BSA peptid jellerini hazırlamak için, peptid BSA seyreltmelerine% 37 formaldehit, bir seferde bir numune çalışan bire bir oranda% 37 formaldehit ekleyin. Hava kabarcıkları oluşturmadan beş ila 10 saniye içinde beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın.
Karıştırdıktan sonra, kapalı mikro santrifüj tüpünü 10 dakika boyunca 85 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin. Tüm peptid BSA ve formaldehit çözeltileri hazırlandıktan ve ısıtıldıktan sonra, jellerin tezgah üstünde beş ila 10 dakika soğumasını bekleyin. Daha sonra, temiz, esnek tek kullanımlık bir laboratuvar spatula kullanarak, jel numunesini mikro santrifüj tüpünden tek parça halinde çıkarın.
Ve her numune için ayrı bir kap kullanarak, en az 15 mililitre nötr tamponlu formalin içeren kapalı bir kaba yerleştirin. Alternatif olarak, yeni bir tek kenarlı tıraş bıçağı kullanarak, mikro santrifüj tüpünün tabanını kesin ve jeli alttan hava veya uygun bir prob ile dışarı itin. Temiz tek kenarlı tıraş bıçağı kullanarak jel koniyi yaklaşık beş milimetre kalınlığında silindirik disklere kesin.
Diskleri bir biyopsi sargısına sardıktan sonra, daha büyük bir jel diski bir kasete ve kalan jel diskleri doku mikroarray yapımında kullanılmak üzere ikinci bir kasete yerleştirin. İşlemden önce, kaset jellerini, her numune için ayrı bir kap kullanarak, jel başına en az 15 mililitre% 10 nötr tamponlanmış formalin içine yerleştirin. Daha sonra, jelleri basınç ve vakum ile büyük bir doku programını izleyerek otomatik bir histoloji doku işlemcisinde işleyin.
Numune işleme tamamlandığında, kasetleri doku işlemcisinden çıkarın ve parafin gömme merkezine taşıyın. Jelleri biyopsi sargısından açtıktan sonra, jelleri parafin içine gömün veya her numune bir jel diskini 15 x 15 milimetrelik küçük bir kalıba gömün. Ve kalan jel diskler ikinci bir büyük kalıpta bir araya gelir.
Her peptid seyreltme serisi için, toplam altı ayrı bölüm içeren iki cam slayt oluşturun. Beş seyreltme serisi numunenin her birinden bir bölüm ve BSA sadece negatif kontrol numunesinden bir bölüm. Slaytları kesitleyip kuruttuktan sonra, her peptid için hazırlanan iki slaytı istenen primer antikor ile boyayın.
Standart İmmünohistokimya protokollerine göre, her jel bölümünde nispeten düzgün bir sinyal görmeyi bekler. Peptit seyreltmelerine karşılık gelen bir dizi sinyal yoğunluğu gösteren farklı jel örnekleri ile. BSA jel doku mikroarray yapısı için, doku mikrodizisinin dört mikrometre kalınlığındaki bölümlerini kesin ve laboratuvar standart protokollerine göre bir tavşan monoklonal antikoru ile boyanır.
Ortaya çıkan leke yoğunluğunu inceleme yoluyla niteliksel olarak değerlendirin veya kantitatif olarak dijital görüntü tarama ve analizi satın alın. Uygun antikorlarla reaksiyona girdikten sonra, negatif kontrol BSA sadece jel örnekleri minimal sinyal gösterdi. Tek bir jel numunesindeki sinyal yoğunluğu nispeten homojendir ve artan antijen konsantrasyonları ile artar.
MDA-MB-175 hücrelerinin% 10'undan fazlası soluk ve tamamen çevresel membranöz boyanma gösterir. Buna karşılık, SKBR-3 hücrelerinin% 10'undan fazlası, yoğun tamamen çevresel membranöz boyama gösterir Formaldehit eklendikten sonra hızlı bir şekilde çalışın, çünkü çözeltiler oda sıcaklığında bile jelleşmeye başlayacaktır. Bu yöntemi, test antikorları sinyal göstermediğinde bile, tahlilin beklendiği gibi yapıldığına dair bize güven vermek için yeni antikorları test ederken IHC kontrolleri yapmak için kullanıyoruz.
Doku veya hücre hattı kontrolleri doğal olarak değişkendir. Sentetik antijen kontrolleri, değişen spesifik ISD reaksiyon koşullarının etkisini daha hassas bir şekilde ölçmemizi sağlar.
