用于免疫组化的合成抗原对照

BSA抗原凝胶是表征良好的可重现IHC标准品，可以补充现有对照。该协议使用标准组织学和IHC试剂和方法来制备已知成分的可重现标准品。这些对照为不同的实验室提供了校准和标准化许多诊断相关检测的IHC检测的机会。

找到合适的溶剂来溶解肽或蛋白质很重要。在不引入气泡的情况下快速混合抗原和甲醛溶液可能很棘手。首先，通过在50毫升锥形管中将5克BSA粉末与14毫升PBS混合，直到均匀分布，制备20毫升25%体积重量的BSA溶液。

涡旋溶液以溶解BSA粉末。将溶液在四摄氏度下保持过夜以完全溶解。第二天，用PBS将最终体积调整为20毫升。

同样，通过将6.26克BSA粉末与13毫升PBS混合，制备20毫升31.3%体积重量的BSA溶液。孵育过夜完全溶解后，用PBS将最终体积调节至20毫升。要测试BSA甲醛混合物是否形成凝胶，请将加热块预热至85摄氏度。

然后将700微升25%BSA溶液与700微升37%甲醛混合。在 5 到 10 秒内上下移液 5 次，充分混合，不会产生气泡。混合后，立即将封闭的微量离心管放入预热至85摄氏度的加热块中。

10分钟后，将管子从加热块上取下。让它冷却并确认凝胶已按预期形成。准备并清楚地标记八个 1.5 毫升微量离心管。

然后制备5x肽储备溶液，通过将全部自由化肽重悬于60微升的适当溶剂中，加入12.5毫摩尔浓度。观察溶液以确保肽完全溶解。然后根据需要添加额外体积的溶剂，根据肽的分子量、质量和纯度制备 12.5 毫摩尔溶液。

在本例中，5x肽储备液的最终体积为626.9微升。其他肽样品将需要不同的最终体积。接下来，准备 150 微升 1x 肽储备液，通过将 30 μL 的 5x 肽储备液稀释到 120 微升溶剂中来加入 2.5 毫摩尔浓度。

将溶液涡旋五秒钟，并在室温下离心。接下来，通过将 140 微升 1x 肽储备液稀释到 560 微升 31.3% BSA 溶液中，制备 700 微升 0.5 毫摩尔肽 BSA 溶液。涡旋后，在室温下离心溶液。

类似地，通过将70微升肽BSA溶液加入630微升25%BSA溶液中，制备四次连续10倍连续稀释的肽BSA储备液。要制备BSA肽凝胶，请以1比1的比例向肽BSA稀释液中加入37%甲醛，一次处理一个样品。在 5 到 10 秒内上下移液 5 次，充分混合，不会产生气泡。

混合后，将封闭的微量离心管置于85摄氏度的加热块中10分钟。制备并加热所有肽BSA和甲醛溶液后，让凝胶在工作台上冷却5至10分钟。接下来，使用干净、灵活的一次性实验室刮刀，从微量离心管中取出凝胶样品。

并将其放入装有至少15毫升中性缓冲福尔马林的密封容器中，每个样品使用单独的容器。或者，使用新的单刃剃须刀片，切下微量离心管的底部，然后用空气或合适的探针将凝胶从底部推出。使用干净的单刃剃须刀将凝胶锥修剪成约5毫米厚的圆柱形圆盘。

将圆盘包裹在活检包装中后，将一个较大的凝胶盘放入一个凝胶盒中，将剩余的凝胶盘一起放入第二个凝胶盒中，用于组织微阵列构建。在处理之前，将盒式凝胶放入每个凝胶至少15毫升10%中性缓冲福尔马林中，每个样品使用单独的容器。接下来，在自动组织学组织处理器中按照压力和真空的大组织计划处理凝胶。

样品处理完成后，从组织处理器中取出暗盒并将它们移动到石蜡包埋中心。从活检包装中解开凝胶后，将凝胶嵌入石蜡中，或者每个样品将一盘凝胶嵌入15×15毫米的小模具中。并将剩余的凝胶盘放在第二个较大的模具中。

对于每个肽稀释系列，创建两个载玻片，总共包含六个独立的切片。五个稀释系列样品中每个样品的一个切片和一个仅BSA阴性对照样品的切片。切片并干燥载玻片后，用所需的一抗对为每种肽制备的两张载玻片进行染色。

根据标准的免疫组织化学方案，期望在每个凝胶切片内看到相对均匀的信号。不同的凝胶样品显示出对应于肽稀释度的信号强度范围。对于BSA凝胶组织微阵列构建，切割组织微阵列的四个微米厚的切片，并根据实验室标准方案用兔单克隆抗体染色。

通过检测定性评估产生的污渍强度，或定量购买数字图像扫描和分析。在与适当的抗体反应后，阴性对照BSA仅凝胶样品显示出最小的信号。单个凝胶样品中的信号强度相对均匀，并随着抗原浓度的增加而增加。

超过 10% 的 MDA-MB-175 细胞显示微弱且完全圆周膜染色。相比之下，超过10%的SKBR-3细胞显示出强烈的完全圆周膜染色一旦加入甲醛，就会迅速起作用，因为即使在室温下溶液也会开始凝胶化。我们在测试新抗体时使用这种方法进行IHC对照，以使我们相信即使测试抗体未显示信号，检测也能按预期进行。

组织或细胞系对照本质上是可变的。合成抗原对照使我们能够更精确地测量改变特定ISD反应条件的影响。