İnsan retinoblastomu çocukluk çağında en sık görülen göz içi kanseri türüdür. Klinik örneklerin elde edilmesi zordur ve fare modelleri retinoblastomu oluşturamaz. Bu nedenle, in vitro retinoblastom oluşumu, retinoblastom oluşumunu, proliferasyonunu ve büyümesini gözlemlemek ve yeni terapötik ajanlar geliştirmek için gereklidir.
Bu protokolün etkinliği yaklaşık% 100'e ulaşabilir, ancak retinoblastom oluşturma süresi 45. günden 120. güne kadar değişkendir. Retinoblastomun bir veya RB bir nakavt insan embriyonik kök hücrelerinin bakımı için, kültür geni, büyüme faktörü ile kaplanmış altı kuyucuklu bir plakada H dokuz hücresini düzenledi ve bazal membran matrisini azalttı ve ortamı her gün değiştirdi. Hücreleri geçmek için, EDTA tamponunda 37 santigrat derecede 3,5 dakika veya oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Hücreleri% 80 birleşene kadar kültürleyin. Daha sonra, retinal hücre farklılaşmasını başlatmak için, ortamı çıkarın ve hücreleri bir mililitre DPBS ile durulayın. Daha sonra, bir mililitre Dispase tamponu ekleyerek ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ederek hücre kolonilerini yükseltin.
Hücre kolonilerini mikroskop altında gözlemleyin. Kolonilerin kenarları yuvarlanmaya başladığında, Dispase tamponunu aspire edin ve hücreleri bir mililitre DPBS ile bir kez hafifçe durulayın. Daha sonra kuyuya bir mililitre orta bir tane ekleyin ve 10 mikrolitrelik standart pipet ucu kullanarak kolonileri parçalara ayırın.
Ortamdaki kalan hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemeden sonra, ortamdaki hücreleri dağıtmak için yaklaşık 50 mikrolitre süpernatant bırakın.
Daha sonra 250 mikrolitre büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi ekleyin ve nazik ajitasyonla karıştırın. Karıştırdıktan sonra, 15 mililitrelik tüpü asılı hücrelerle birlikte 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. 20 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreler ve büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi katılaşmış bir jel oluşturmalıdır.
Ardından, 15 mililitrelik tüpe bir mililitre orta bir tane ekleyin. Bir mililitrelik pipet kullanarak, kümeyi dağıtmak için katılaşmış jeli iki ila üç kez pipetleyin. Daha sonra dokuz mililitre daha orta bir tane ekleyin ve hücre süspansiyonunu 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına aktarın.
Çanağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bu sıfır günü olarak kabul edilir. İlk gün, hücreleri mikroskop kullanarak inceleyin.
Ortalama olarak, bir jel parçasında üç ila dört kist gözlenir. Beşinci günde, süpernatantı 15 mililitrelik bir tüpte toplayarak, kistlerin dibe çökmesine izin vererek ve süpernatantı taze orta olanla değiştirerek ortamı değiştirin. Tüpteki kistleri iki 10 santimetrelik kaba dağıtın ve her tabakta en az 300 kist sağlayın.
Yedinci günde, yemeğe bağlı kistlerin çoğu yayılır ve yapışkan koloniler oluşturur. 10. günde, ortamı taze orta olanla değiştirin ve tüm kistlerin yemeğe bağlı kalmasını sağlayın. Hücrelerin yayıldığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında 13 ila 17. günler arasında gözlemleyin.
15. günde, hücreleri bir mililitre DPBS ile bir kez duruladıktan sonra, bir mililitre Dispase çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş dakika sonra, Dispase tamponunu çıkarın ve kültürleri bir mililitre DPBS ile hafifçe durulayın. Daha sonra her 10 santimetrelik kaba 10 mililitre orta iki tane ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatöründe inkübe edin.
24 saat sonra, yapışkan kültürler kendiliğinden ayrılır ve retinal organoidlere toplanır. Ayrılmadan üç gün sonra, hücreleri hücre kültürü kabından 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Organoidler yerleştiğinde, süpernatantı tüpten çıkarın ve organoidleri takip eden dört gün boyunca 10 mililitre orta iki ile yeni bir yapışkan olmayan Petri kabına aktarın.
Ayrılmadan bir hafta sonra, ortamı orta üçe değiştirin ve bu günden itibaren organoidleri orta üçte kültürleyin. Retinal organoid kültürün 27. gününde optik vezikül mimarisi belirgindir ve organoidlerin yaklaşık %90'ı bu yapıyı gösterir. Retinoblastomun ilk tespiti 45. günde gerçekleşir ve 50. günde elle tutulur hale gelir.
90. güne kadar büyüdüğünde, optik vezikül yapıları esas olarak retinoblastom tarafından kaplanır. Retinoblastom şimdi izole edilebilir ve bir hücre hattı olarak daha fazla kültürlenebilir. 105. günde, retinal organoidlerin% 80'inden fazlası retinoblastom tarafından tamamen sarılır.
Bu organoidler, proliferasyon belirteci Ki67 ve onkogen belirteci SYK'yı, H dokuz türevi retinal organoidlere kıyasla yüksek oranda eksprese ederek tümörigenezi gösterir. Ek olarak, retinoblastom organoidlerinde koni öncü belirteci ARR3 ve fotoreseptör öncü belirteci CRX'in yüksek ekspresyonu, koni öncü hücrelerinden kaynaklandıklarını göstermektedir. Retinoblastom oluşumunun üç morfolojik aşamasında elde edilen inferior ve superior sonuçlar burada gösterilmiştir.
Farklılaşmış ve farklılaşmamış insan embriyonik kök hücreleri, morfolojilerine göre kolayca ayırt edilebilir. Diferansiye olmayan hücreler retinoblastom oluşumu için seçilir. Beşinci günde, üretilen küre katı yerine içi boş olmalıdır.
Retinoblastom, optik vezikül mimarisini gösteren retinal organoidlerden türetilir. İnferior organoidlerden retinoblastom oluşmaz. İşlem gerçekleştirilirken, tüm uçlar soğutulmalı ve bazal membran matrisi tüpe eklenmeden önce dört derecede eritilmelidir.
Bu, bu farklılaştırma protokolü için önemli bir adımdır.
