人视网膜母细胞瘤是儿童期最常见的眼内癌类型。临床样本难以获得，小鼠模型不能形成视网膜母细胞瘤。因此，体外视网膜母细胞瘤的产生对于观察视网膜母细胞瘤的发生、增殖和生长以及开发新型治疗药物至关重要。
该方案的效率可以达到约100%，尽管视网膜母细胞瘤生成的持续时间从第45天到第120天是可变的。为了维持视网膜母细胞瘤一或RB一敲除人胚胎干细胞，将基因编辑的H九细胞培养在涂有生长因子还原基底膜基质的六孔板中，并每天更换培养基。要传代细胞，请将它们在37摄氏度下在EDTA缓冲液中孵育3.5分钟或在室温下孵育5分钟。
培养细胞直到它们达到80%汇合。然后，为了启动视网膜细胞分化，去除培养基并用一毫升DPBS冲洗细胞。接下来，通过加入一毫升分散酶缓冲液并在 37 摄氏度下孵育五分钟来提升细胞集落。
在显微镜下观察细胞集落。一旦菌落的边缘开始展开，吸出分散酶缓冲液并用一毫升DPBS轻轻冲洗细胞一次。然后将一毫升培养基加入孔中，并使用10微升标准移液器吸头将菌落切成碎片。
使用细胞刮刀刮除培养基中剩余的细胞。通过在15毫升管中离心来收获细胞。离心后，留下约50微升上清液以分散培养基中的细胞。
然后加入250微升生长因子还原基底膜基质，轻轻搅拌混合。混合后，将装有悬浮细胞的15毫升管放入37摄氏度的培养箱中。孵育20分钟后，细胞和生长因子降低的基底膜基质应形成固化凝胶。
接下来，将一毫升培养基加入 15 毫升管中。使用一毫升移液器，将固化的凝胶移液两到三次以分散团块。然后再加入9毫升培养基，并将细胞悬液转移到10厘米的细胞培养皿中。
将培养皿在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。这被认为是零天。在第一天，使用显微镜检查细胞。
平均而言，在一块凝胶中观察到三到四个囊肿。在第五天，通过将上清液收集到15毫升管中来更换培养基，使囊肿沉淀在底部并用新鲜培养基替换上清液。将管中的囊肿分散到两个 10 厘米的培养皿中，确保每个培养皿中至少有 300 个囊肿。
在第七天，附着在培养皿上的大多数囊肿扩散并形成粘附菌落。在第 10 天，用新鲜培养基更换培养基，确保所有囊肿都附着在培养皿上。从第13天到第17天在显微镜下观察细胞，以确保细胞扩散。
在第15天，用一毫升DPBS冲洗细胞一次后，加入一毫升分散酶溶液并在37摄氏度下孵育。五分钟后，取出分散酶缓冲液，用一毫升DPBS轻轻冲洗培养物。然后在每个 10 厘米培养皿中加入 10 毫升培养基 2，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中孵育。
24小时后，贴壁培养物自发分离并组装成视网膜类器官。分离三天后，将细胞培养皿中的细胞收集在15毫升管中。当类器官沉淀时，从管中取出上清液并将类器官转移到新的非粘附培养皿中，并在接下来的四天内加入10毫升培养基二。
分离一周后，将培养基更换为培养基三，从这一天开始，在培养基三中培养类器官。在视网膜类器官培养的第27天，视囊结构很明显，大约90%的类器官显示出这种结构。视网膜母细胞瘤的首次检测发生在第 45 天，并在第 50 天变得可触及。
当它生长到第90天时，视囊泡结构主要被视网膜母细胞瘤包裹。视网膜母细胞瘤现在可以作为细胞系进一步分离和培养。在第105天，超过80%的视网膜类器官被视网膜母细胞瘤完全包裹。
与H Nine衍生的视网膜类器官相比，这些类器官高度表达增殖标志物Ki67和癌基因标志物SYK，表明肿瘤发生。此外，视锥体前体标记物ARR3和光感受器前体标记CRX在视网膜母细胞瘤类器官中的高表达表明它们起源于视锥细胞前体细胞。这里描述了视网膜母细胞瘤生成的三个形态学阶段的劣质和优越结果。
分化和未分化的人类胚胎干细胞可以根据其形态轻松区分。选择未分化的细胞进行视网膜母细胞瘤的形成。在第五天，生成的球体应该是空心的而不是固体。
视网膜母细胞瘤来源于显示视囊泡结构的视网膜类器官。下级类器官不会产生视网膜母细胞瘤。在执行该程序时，应冷却所有尖端，并将基底膜基质熔化为四度，然后再将其添加到管中。
这是该分化方案的关键步骤。
