Bu prosedürlerin genel amacı, tekrarlanabilirliği artırmak için biyofilmleri en uygun şekilde toplamak ve ayrıştırmaktır. Bu videoda, her biri farklı bir yüzey türünden hasat ve ayrıştırmaya odaklanan üç teknik gösterilecektir. Bu video, CDC biyofilm reaktöründen bir polikarbonat kupon gibi sert gözeneksiz bir yüzeyden vorteks ve sonikasyon biyofilmi için uygun teknikleri gösterecektir.
İkincisi, biyofilmin damlama akış reaktöründe yaygın olarak bulunan sert gözeneksiz borosilikat cam yüzeyden kazınması ve homojenleştirilmesi. Üçüncüsü, kateter modelinde yaygın olarak bulunan gözenekli bir silikon boru yüzeyinden biyofilmin kazınması, girdablanması ve sonikleştirilmesi. Merhaba, benim adım Kelly Buckingham-Meyer burada, Standardize Biofilm Methods Lab'de.
Laboratuvarımızda biyofilm yöntemlerini dört bileşene ayırıyoruz: büyüme, arıtma, örnekleme ve analiz. Hakemli literatürde, biyofilmlerin nasıl örneklendiği veya hasat edildiği ve bir yüzeyden nasıl ayrıştırıldığına dair detaylar tipik olarak seyrektir. Bu videonun nedeni budur.
Laboratuvarımız standartlaştırılmış biyofilm yöntemleri geliştirip test ettiğinden, en yaygın üç biyofilm toplama ve ayrıştırma yönteminin tanımlandığı kapsamlı bir literatür taraması yaptık. Bu yöntemler, bir polikarbonat kupondan biyofilmi vorteksleme ve sonikleştirme, borosilikat cam kupondan biyofilmi kazıma ve homojenleştirme ve silikon borudan biyofilmi kazıma, vorteks ve sonikleştirmedir. Kağıda yazılmış yöntemler güçlü olsa da, iş arkadaşım Lindsey Miller ve ben tarafından sunulan teknik ayrıntıları içeren videonun yardımcı olacağını umuyoruz.
Başlamak için, CDC Biyofilm Reaktörü kullanılarak Yüksek Kesme ve Sürekli Akış ile Yetiştirilen Pseudomonas aeruginosa Biyofilminin Niceliği için Standart Test Yöntemi olan ASTM Standardı E2562'ye göre olgun Pseudomonas aeruginosa 15442 biyofilmini büyütün. 48 saatlik büyüme süresinin sonunda, kuponları ASTM Standardı E2871'e göre, CDC Biyofilm Reaktöründe Tek Tüp Yöntemi Kullanılarak Yetiştirilen Biyofilme Karşı Dezenfektan Etkinliğini Belirlemek İçin Standart Test Yöntemine göre işlemeye ve numune almaya hazırlanın. Daha sonra otoklavlanmış sıçrama korumalarını, alevle sterilize edilmiş forseps kullanarak steril 50 mililitrelik konik tüplere aseptik olarak yerleştirin.
Tedavi görecek tüm tüpler için tekrarlayın. Kontrol kuponları için tüplerin bir sıçrama korumasına ihtiyacı yoktur. CDC biyofilm reaktöründen bir çubuğu aseptik olarak çıkarın ve 30 mililitre steril seyreltme suyunda durulayın.
Bu, gevşek bir şekilde bağlanmış hücreleri biyofilmden çıkaracaktır. Çubuğu, sıçrama korumaları olan numune tüplerinin üzerinde tezgah üstüne paralel tutun. Alevle sterilize edilmiş bir Allen anahtarı kullanarak, biyofilm kaplı bir kuponu tüpe düşürmek için set vidalarını gevşetin.
İstediğiniz kupon sayısı için tekrarlayın. Sıçrama korumalarını çıkarın ve sıçrama korumalarını sterilizasyon için ayrı bir kaba yerleştirin. Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, sıvının tüpün duvarının iç kısmından aşağı akması için tüplere yavaşça dört mililitre işlem veya kontrol pipetin.
Kuponun altındaki hava kabarcıklarının yer değiştirmesi için tüpün tabanını yavaşça döndürün. Her ekleme arasında 30 ila 60 saniye bekleyin. Belirtilen temas süresinin sonunda, pipet, 36 mililitre nötrleştirici ile aynı sırayla tüplere tedavi veya kontrol uygulandı.
Her tüpü 30 artı veya eksi beş saniye boyunca en yüksek ayarda vorteks yapın ve tam bir vorteks elde edilmesini sağlayın. Tüpleri, gazdan arındırılmış sonikatörde asılı olan tüp rafına, banyodaki su seviyesi, tüplerdeki su seviyesine eşit olacak şekilde yerleştirin. Örnekleri 45 kilohertz,% 100 güç ve 30 artı veya eksi beş saniye boyunca normal fonksiyonda sonikleştirin.
Vorteks ve sonikasyon döngülerini tekrarlayın ve toplam beş döngü için son bir vorteks ile bitirin. Son olarak, numuneyi seri olarak seyreltin, seyreltmeyi R2A agar üzerine yerleştirin ve plakaları 36 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. Kolonileri kaplama yöntemine uygun olarak sayın ve verileri kaydedin.
Bu bir sonraki biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniği, damlama akışı reaktöründe standart olan sert gözeneksiz kuponlar için yararlıdır. ASTM Standardı E2647'ye göre olgun bir Pseudomonas aeruginosa 15442 biyofilmi yetiştirin Düşük Kesme ve Sürekli Akışlı Damlama Akışlı Biyofilm Reaktörü Kullanılarak Yetiştirilen Pseudomonas aeruginosa Biyofilminin Niceliği için Standart Test Yöntemi. Numune alma istasyonunu bir numune alma panosu, bir beherde% 95 etanol, bir alkol brülörü, hemostatlar, bir kupon çıkarma aracı, steril seyreltme suyu içeren beherler ve kuponları durulamak için seyreltme tüpleri içerecek şekilde ayarlayın.
Pompayı kapatın, kanal kapağını çıkarın ve biyofilmi rahatsız etmemeye dikkat ederek kuponu çıkarmak için steril kupon çıkarma aleti ve hemostatlar kullanın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde bulunan 45 mililitre steril seyreltme suyuna sıvı bir hareketle hafifçe daldırarak kuponu durulayın. Kuponu kaldırmak için hareketi hemen tersine çevirin.
Kuponu 45 mililitre steril seyreltme suyu içeren bir beherin içine yerleştirin. Biyofilm kaplı kupon yüzeyini, steril bir spatula veya kazıyıcı kullanarak yaklaşık 15 saniye boyunca aşağı yönde kazıyın. Spatula veya kazıyıcıyı beherde karıştırarak durulayın.
Kazıma ve durulama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın ve kupon yüzeyinin tam olarak kaplanmasını sağlayın. Kuponu steril kabın üzerinde 60 derecelik bir açıyla tutarak ve kuponun yüzeyine bir mililitre steril seyreltme suyu pipetleyerek, durulayın. Toplam beş durulama için tekrarlayın.
Beherdeki son hacim şimdi 50 mililitredir. Biyogüvenlik kabininde çalışarak, kazınmış biyofilm numunesini homojenize edin. Homojenizatöre steril bir homojenizatör probu takın.
Prob ucunu sıvıya yerleştirin ve homojenizatörü açın ve 20.500 RPM'ye kadar yükseltin. Numuneyi 30 saniye boyunca homojenize edin. RPM'yi kapatın ve homojenizatörü kapatın.
Yukarıda açıklandığı gibi 20.500 RPM'de dokuz mililitrelik steril seyreltme boşluğunda 30 saniye boyunca homojenize ederek biyofilm numuneleri arasındaki probu sterilize edin. Dokuz mililitrelik bir 70% etanol tüpünü 30 saniye boyunca homojenize edin ve probu ayırın ve bir dakika boyunca etanol tüpünde bekletin. İki ek seyreltme boşluğunu homojenize edin.
Ayrıca, her numune için steril tek kullanımlık homojenizatör probu kullanılabilir. Homojenize numuneyi seri olarak seyreltin, uygun kaplama yöntemini kullanarak seyreltmeleri R2A üzerine plakalayın ve plakaları 36 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. Kolonileri sayın ve verileri kaydedin.
Bu son biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniği, kateter modelinde kullanılan silikon boru gibi gözenekli borularda yetiştirilen biyofilm için yararlıdır. Bu prosedüre başlamak için, silikon kateter borusunda olgun bir E.coli 53498 biyofilm yetiştirin. Numune alma malzemelerini hazırlayın: durulanmış tüpler, steril bir santrifüj tüpü, boş bir steril Petri kabı, alevle sterilize edilmiş paslanmaz çelik hemostatlar, makas, zamanlayıcı ve cetvel.
Pompa duraklatıldığında, borunun dışını temizlemek için% 70 etanol kullanın. Konektöre bağlı alandan kaçınarak uçtan iki santimetre ölçün ve kesme yerlerini belirlemek için boruyu işaretleyin. Alevle sterilize edilmiş makasla boruyu iki santimetre işaretinde kesin.
Planktonik hücreleri çıkarmak için boru segmentini durulayın. Alevle sterilize edilmiş forsepslerle, boru segmentini nazikçe 20 mililitre steril seyreltme suyuna batırın, ardından hemen çıkarın. Segmenti 10 mililitre nötrleştiriciye yerleştirin.
Alevle sterilize edilmiş forsepslerle, boru segmentini tutun ve borunun tüm iç alanları kazınana kadar steril bir ahşap aplikatör çubuğu ile kazıyın. Bazen çubuğu 10 mililitre nötrleştirici içinde durulayın ve segmenti numune tüpüne geri yerleştirin. Kazınmış boru segmenti artık 10 ila sıfır veya sıfır seyreltmedir.
Her tüpü 30 artı veya eksi beş saniye boyunca en yüksek ayarda vorteksleyin. Tüpleri, sonikatör banyosunda asılı olan tüp rafına yerleştirin, böylece banyodaki su seviyesi tüplerdeki sıvı seviyesine eşit olacaktır. 45 kilohertz,% 100 güç ve 30 artı veya eksi beş saniye boyunca normal işlevde sonikasyon.
Bu vorteks ve sonikasyon döngüsünü tekrarlayın, ardından son vorteks ile bitirin. Numuneleri tamponlanmış suda seri olarak seyreltin. Uygun kaplama yöntemini kullanarak triptik soya agar üzerine plaka yapın ve daha sonra tüpleri 24 saat boyunca 36 artı veya eksi iki santigrat derecede inkübe edin.
Kolonileri kullanılan kaplama yöntemine uygun olarak sayın ve aritmetik ortalamayı hesaplamak için verileri kaydedin. Danielle Or ve Blaine Fritz tarafından çekilen bu dört görüntü, bu hasat ve ayrıştırma prosedürünün önemini göstermeye yardımcı oluyor. Bu kuponların dördü de, vorteks ve sonikasyon işleminden önce ve sonra kuponlarda bulunan Pseudomonas aeruginosa biyofilm miktarını görselleştirmeye yardımcı olmak için kristal menekşe ile boyanmıştır.
Kupon A tamamen biyofilm ile kaplıdır, B, C ve D kuponlarının hepsi yüzeylerinde önemli ölçüde daha az biyofilme sahiptir. Kuponlar B, C ve D, daha önce açıklanan vorteks ve sonikasyon sürecine tabi tutuldu. Lindsey Miller tarafından 12.5X büyütmede konfokal mikroskopta çekilen bu iki görüntü, arka ışık canlı / ölü lekesi ile muamele edilen bir Pseudomonas aeruginosa biyofilmini göstermektedir.
Soldaki görüntü 45 kilohertz ve% 10 güçte sonikleştirilirken, sağdaki görüntü 45 kilohertz ve% 100 güçte sonikleştirildi. Açıkçası, soldaki kupon, sağdaki kupona kıyasla yüzeyinde çok daha fazla biyofilm kalmaktadır. Bu son şekil, farklı sonikasyon parametrelerinin manipülasyonunun, kupon yüzeyinden çıkarılan Pseudomonas aeruginosa biyofilm miktarını nasıl etkilediğini göstermektedir.
Tüm bu kuponlar 45 kilohertz,% 100 güç ve normal ayarda 30 artı veya eksi beş saniye boyunca sonikleştirildi. Bu görüntüler Lindsey Miller tarafından 12.5X büyütmede çekildi. Birinci sıradaki kuponlar seyreltme suyunda sonikleştirilirken, ikinci sıradaki kuponlar DE nötrleştirici et suyunda sonikleştirildi.
Seyreltme suyuna kıyasla bir yüzey aktif madde içeren DE suyunda sonikleştirilen kuponlarda daha az biyofilm kaldığı görülmektedir. A, B, E ve F kuponlarının hepsi 10 mililitrelik bir hacimde sonikleştirilirken, C, D, G ve H kuponları 40 mililitre çözelti içinde sonikleştirildi. Daha küçük hacimlerde sonikleştirilen kuponlarda açıkça daha az biyofilm var.
A, C, E ve G kuponları banyoda aynı anda üç tüple sonikleştirilirken, B, D, F ve H kuponları aynı anda 12 tüplü bir banyoda sonikleştirildi. Daha az tüple sonikleştirilen örneklerin üstün biyofilm hasadı sergilediği görülmektedir. Nihayetinde, tüplerdeki hacmi en aza indirmek, bir kerede sonikleştirilen tüp sayısını azaltmak ve DE nötralize edici et suyunun kullanılması, gelişmiş biyofilm hasadına katkıda bulunuyor gibi görünmektedir.
Biyofilmi hasat etmek ve ayrıştırmak için mükemmel bir yöntem yoktur, ancak bazı yaklaşımlar farklı yüzeyler ve / veya uygulamalar için daha iyidir. Bu videoda gösterilen teknikler, literatür taramasına göre en yaygın üç yöntemdir. Bu üç teknik, araştırmacılar için bir başlangıç noktası sağlayabilir.
Seçilen hasat ve ayrıştırma yöntemini doğrulamak için zaman ayırmak önemlidir. Tüm ekipman biraz farklıdır, bu nedenle yöntem standartlaştırılmış olsa bile, kullanılan ekipman için işlemi onaylamak hala ihtiyatlıdır. Araştırmalar, yanlış seçimlerin önyargılı test sonuçlarına yol açabileceğini göstermiştir.
Bu videoyu izledikten sonra, bu bilgiler araştırmacıların hangi yöntemin kullanılacağı konusunda daha bilinçli kararlar vermelerine yardımcı olacak ve üç yüzey tipi için tekrarlanabilirliği ve ücretsiz hasat ve ayrıştırma tekniklerini iyileştirme konusunda rehberlik sağlayacaktır.
