这些程序的总体目标是以最佳方式收获和分解生物膜，以提高可重复性。本视频将演示三种技术，每种技术都侧重于从不同表面类型中收获和分解。该视频将演示一种技术的正确技术，即从坚硬的无孔表面（例如来自CDC生物膜反应器的聚碳酸酯试样）涡旋和超声处理生物膜。
二、将生物膜刮除和均质化掉滴流反应器中常见的坚硬无孔硼硅酸盐玻璃表面。第三，从导管模型中常见的多孔硅胶管表面刮擦，涡旋和超声处理生物膜。嗨，我的名字是Kelly Buckingham-Meyer，在标准化生物膜方法实验室。
在我们的实验室中，我们将生物膜方法分解为四个组成部分:生长，处理，采样和分析。在同行评审的文献中，关于生物膜如何从表面取样或收获和分解的细节通常很少。这就是制作此视频的原因。
由于我们的实验室开发和测试标准化的生物膜方法，我们进行了广泛的文献综述，其中确定了三种最常见的生物膜收获和解聚方法。这些方法是从聚碳酸酯试样中对生物膜进行涡旋和超声处理，从硼硅酸盐玻璃试样中刮擦和均质化生物膜，以及从硅胶管中刮擦，涡旋和超声处理生物膜。虽然写在纸上的方法很强大，但我们希望我和我的同事林赛·米勒（Lindsey Miller）介绍的技术细节视频会有所帮助。
首先，根据ASTM标准E2562培养成熟的铜绿假单胞菌15442生物膜，这是使用CDC生物膜反应器定量铜绿假单胞菌生物膜的标准测试方法。在48小时生长期结束时，根据ASTM标准E2871准备处理和样品优惠券，这是使用单管法确定消毒剂对CDC生物膜反应器中生长的生物膜功效的标准测试方法。然后使用火焰灭菌镊子无菌地将高压灭菌的防溅罩插入无菌的50毫升锥形管中。
对所有将要接受治疗的管子重复上述步骤。用于控制优惠券的管子不需要防溅罩。无菌地从CDC生物膜反应器中取出一根棒，并在30毫升无菌稀释水中冲洗。
这将从生物膜中去除松散附着的细胞。将杆平行于工作台顶部固定在带有防溅罩的样品管上。使用火焰灭菌的内六角扳手，拧松固定螺钉，将生物膜涂层的试样放入管中。
重复所需数量的优惠券。取下防溅罩，并将防溅罩放在单独的容器中进行灭菌。使用五毫升血清学移液器，将四毫升的处理或对照液缓慢移液到管中，使液体沿着管壁内侧流动。
轻轻旋转管的底部，使试样下的任何气泡都被置换。每次添加之间留出 30 到 60 秒。在指定的接触时间结束时，将36毫升中和剂移液到管中，其顺序与施加处理或对照的顺序相同。
在最高设置下涡旋每个管子30加或减去5秒，并确保达到完全涡旋。将管子放在悬挂在脱气超声仪中的管架中，使浴槽中的水位等于管中的水位。以45千赫兹，100%功率和正常功能30加或减去5秒对样品进行超声处理。
重复涡旋和超声检查循环，并以最终涡旋结束，共五个循环。最后，连续稀释样品，将稀释液置于R2A琼脂上，并在36摄氏度下孵育平板24小时。根据电镀方法对菌落进行计数并记录数据。
这种下一种生物膜收获和解聚技术对于滴流反应器中标配的硬质无孔试样非常有用。根据ASTM标准E2647培养成熟的铜绿假单胞菌15442生物膜，这是使用低剪切和连续流动的滴流生物膜反应器生长的铜绿假单胞菌生物膜定量的标准测试方法。设置采样站，包括采样板，烧杯中的95%乙醇，酒精燃烧器，止血器，试样去除工具，带有无菌稀释水的烧杯以及用于冲洗试样的稀释管。
关闭泵，取下通道盖，使用无菌试样去除工具和止血剂取出试样，注意不要干扰生物膜。通过以流体运动轻轻浸入50毫升离心管中包含的45毫升无菌稀释水中来冲洗试样。立即反转动作以删除优惠券。
将试样放入装有45毫升无菌稀释水的烧杯中。使用无菌刮刀或刮刀向下刮擦生物膜覆盖的试样表面约15秒。通过在烧杯中搅拌来冲洗刮刀或刮刀。
重复刮擦和漂洗过程三到四次，确保完全覆盖试样表面。冲洗试样，方法是将其以60度角放在无菌烧杯上，并在试样表面上移液一毫升无菌稀释水。重复，总共冲洗五次。
烧杯中的最终体积现在是50毫升。在生物安全柜中工作，使刮下的生物膜样品均质化。将无菌均质器探头连接到均质器上。
将探针尖端放入液体中，打开均质机，升压至20， 500 RPM。使样品均质30秒。调低转速并关闭均质机。
如上所述，通过在9毫升无菌稀释空白中以20， 500 RPM均质30秒来消毒生物膜样品之间的探针。将9毫升70%乙醇管匀浆30秒，然后取下探针，使其在乙醇管中静置一分钟。均质化两个额外的稀释坯料。
此外，每个样品都可以使用无菌的一次性均质器探头。连续稀释均质样品，使用适当的电镀方法将稀释液在R2A上，并在36摄氏度下孵育板24小时。计算菌落并记录数据。
这种最终的生物膜收获和解聚技术对于在多孔管中生长的生物膜非常有用，例如导管模型中使用的硅胶管。要开始此过程，请在硅胶导管中培养成熟的大肠杆菌53498生物膜。准备取样材料:冲洗管，无菌离心管，空无菌培养皿，火焰灭菌不锈钢止血器，剪刀，计时器和尺子。
泵暂停后，使用70%乙醇清洁管道外部。测量距离末端两厘米，避开连接到连接器的区域，并标记管道以确定切割位置。用火焰灭菌剪刀，将管道切成两厘米的标记。
冲洗管段以除去浮游细胞。用火焰灭菌的镊子，将管段轻轻浸入20毫升无菌稀释水中，然后立即取出。将该段放入10毫升中和剂中。
使用火焰灭菌镊子，握住管段并用无菌木制涂抹器刮刀刮，直到刮掉管子的所有内部区域。偶尔在10毫升中和剂中冲洗棒，并将该段放回样品管中。刮擦的管段现在是10到零或零稀释。
在最高设置下涡旋每个管子30加或减去五秒钟。将管子放在悬挂在超声仪浴中的管架中，使得浴槽中的水位等于管中的液位。以45千赫兹，100%功率和正常功能30加或减去5秒的超声处理。
重复这个漩涡和超声循环，然后以最终的漩涡结束。在缓冲水中连续稀释样品。使用适当的电镀方法在胰液大豆琼脂上平板，然后将管在36加或减两摄氏度下孵育24小时。
根据所使用的电镀方法对菌落进行适当的计数，并记录数据以计算算术平均值。Danielle Or和Blaine Fritz拍摄的这四张照片都有助于说明这种收获和分解过程的重要性。所有这四个试样都用结晶紫染色，以帮助可视化在涡旋和超声处理过程之前和之后存在于药样上的铜绿假单胞菌生物膜的数量。
优惠券A完全覆盖在生物膜中，而优惠券B，C和D在其表面上的生物膜都少得多。试样B，C和D都经历了前面描述的涡旋和超声处理过程。Lindsey Miller在共聚焦显微镜下以12.5倍放大倍率拍摄的这两张照片描绘了用背光活/死染色处理的铜绿假单胞菌生物膜。
左边的图像以45千赫兹和10%的功率超声处理，而右边的图像以45千赫兹和100%的功率超声处理。显然，与右侧的优惠券相比，左侧的优惠券表面上残留的生物膜要多得多。最后一张图显示了对不同超声处理参数的操纵如何影响从试样表面去除的铜绿假单胞菌生物膜的量。
所有这些优惠券均以45千赫兹，100%功率和正常设置30加或减去5秒进行超声处理。这些图像是由Lindsey Miller以12.5倍放大倍率拍摄的。第一排的试样在稀释水中超声处理，而第二排的试样在DE中和肉汤中超声处理。
与稀释水相比，在含有表面活性剂的DE肉汤中超声处理的试样上剩余的生物膜似乎较少。试样A，B，E和F均以10毫升体积超声处理，而试样C，D，G和H在40毫升溶液中超声处理。在较小体积中超声处理的试样上的生物膜明显较少。
优惠券A，C，E和G在浴中一次用三个管子超声处理，而优惠券B，D，F和H在一次有12个管子的浴中超声处理。似乎用较少的管子超声处理的样品表现出优异的生物膜收获。最终，最大限度地减少试管中的体积，减少一次超声处理的试管数量，以及使用DE中和肉汤似乎都有助于增强生物膜的收获。
没有完美的方法来收获和分解生物膜，但有些方法更适合不同的表面和/或应用。根据文献综述，本视频中演示的技术是三种最常见的方法。这三种技术可以为研究人员提供一个起点。
花时间验证所选的收获和分解方法非常重要。所有设备都略有不同，因此即使方法已经标准化，对于所使用的设备确认工艺仍然是谨慎的。研究表明，不正确的选择可能会导致有偏见的测试结果。
观看此视频后，这些信息有望帮助研究人员就使用哪种方法做出更明智的决定，并为提高三种表面类型的再现性以及互补的收获和分解技术提供指导。
