Bu araştırma, Ulusal Savunma Tıp Koleji'nden ve Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'nın inatçı hastalıklarla ilgili araştırmalar için sağlık ve çalışma bilimleri araştırma hibesi ile desteklendi.

Deneysel protokol, Ulusal Savunma Tıp Koleji Hayvan Araştırma Komitesi (no. 16058) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar standart laboratuvar yemeklerinde (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japonya) muhafaza edildi. Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak tedavi edildi.
1. Lenfositlerin toplanması ve ayrılması
NOT: Lenfositler taze olması ve depolanamaması gerektiğinden, her deney için sıçanlardan toplanmalıdır. Ek olarak, bağırsak-tropik lenfositler doğrudan dolaştıkları torasik kanaldan toplanmalıdır. Tüm prosedürlerin 6 saat içinde tamamlanması beklenir ve tüm aletler, eldivenler ve yüzeyler temizdir. Hayvanları fizyolojik olarak stabil bir durumda tutmak için, deneyde kullanılan tüm tuzlu su ve diğer sıvılar sıcak tutulmalıdır.
<ol><li>Sıcak suya (yaklaşık 80-90 °C) batırdıktan sonra heparin eğrisi (yaklaşık 5 mm yarıçapı) gibi bir kavis tüpü (1 mm çapında) oluşturur ve birkaç saat önceden yapışkan bant kullanarak plastik bir tahtaya sabitleyin.</li>
	<li>Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) ve Betulphar (2.5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile erkek bir Wistar sıçanını (8-12 hafta) uyuşturun ve bir saç kesme makinesi kullanarak karnın vücut kıllarını kesin. Tıraş olduktan sonra saçları sıkıca çıkarın, böylece saç karın boşluğuna girmez.</li>
	<li>İşlem için gerekli olan sabit anestezi derinliğinin parmak sıkışması ile elde edildiğini doğruladıktan sonra orta çizgiden sol altkozal bölgeye yatay olarak cerrahi makasla bir kesi yapın. Işık altındaki damarları izleyerek parietal peritondaki kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	<li>Mideyi ıslak gazlı bezle sarın ve retroperitoneal organları ortaya çıkarmak için mideyi hafifçe vücudun dışına doğru hareket ettirin. Cerrahi makas kullanarak omurganın erektör kasları ile yağ dokusu arasına bir çentik yerleştirin ve parmaklarla açıkça ayırın.</li>
	<li>Torasik kanalın etrafındaki bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Fazla bağ dokusu yaşla birlikte artar. Torasik kanalın 20 mm uzunluğu görünene kadar diyaframın sol haçlarının hemen altından kaudally olarak ortaya çıkın. Hassas cımbız veya ıslak pamuklu çubuklar kullanarak torasik kanal ve aort arasındaki yapışıklıkları hafifçe ayırın.<ol>
<li>Bu işlemi dikkatlice gerçekleştirin, çünkü bazı sıçanlar, lenf pleksusunun (örümcek ağları gibi yayılan küçük torasik kanallar) daha yüksek bir konumu nedeniyle torasik kanal veya kısa bir torasik kanal üzerinden geçen karın arterinden dallanma arteriküllerine sahiptir. Ödemi önlemek için torasik kanala gereksiz temastan kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diyaframın sol haçlarının hemen altındaki torasik kanala bir dize (3-0 ipek) ile bir bağ uygulayın. Kaudal torasik kanal distended olur.</li>
	<li>Cerrahi makasın kesme kenarını bıçaklayarak karın duvarında bir delik (5 mm çapında) yapın, saç tokası kavisli kavis tüpünü geçirin ve tüpü bir noktada iliopsoas kasında lige edin. Kanülasyon tüpünü 10 U/mL heparin içeren normal salin ile doldurun.</li>
	<li>Distended torasik kanalın altına bir ip (3-0 ipek) yerleştirdikten sonra, torasik kanalı bir kanülasyon tüpünün keskin bir şekilde kesilmiş kenarıyla bıçaklayın, kuyruğa doğru yaklaşık 5 mm'lik bir şekilde kanülasyona doğru kanülat ve sabitleme için torasik kanalı kanülasyon tüpü ile kesin.</li>
	<li>Dehidrasyonu önlemek için salin sağlamak için, hassas cımbız kullanarak mide karıncalanmasının ön duvarında bir delik (3 mm çapında) oluşturun ve silikon tüpü (2 mm çapında) pirorik halkadan duodenuma geçirin. Bir yarayı diktikten ve Bollman'ın kafeslerindeki hayvanların bakımını yaptıktan sonra, silikon tüpten her sıçanın duodenumuna 3 mL / s akış hızında şeker yüklü salin aşılamaya başlayın. Tüm kafesi sıcak tutmak için bir kağıt havlu ile örtün.</li>
	<li>Kanülasyon tüpünü, 6 U/mL heparin, %10 fetal sığır serumu ve RPMI 1640 ortamı (pH 7.4; malzeme tablosuna bakın) içeren buz üzerindeki 50 mL'lik konik tüpün kapağının ortasındaki deliğe sabitlayın ve buz üzerinde torasik kanal lenfositleri (TDL' ler) toplayın. Tüpün içindeki fibrin pıhtı oluşumuna bağlı olarak kanüle edilmiş tüp tıkanıklığını önlemek için tüpün ucunu konik tüpün duvarına temas etmemeye dikkat edin. Yaklaşık 1.0 x 10 8 ~109lenfosit içeren lenf sıvısı (yaklaşık20 mL) 6 saat içinde elde edilebilir. Lenfositleri tam anestezi altında elde etmek için anestezi düzlemi izlenir ve lenf akışı uygun şekilde gözlenir. Aynı anestezikler, sıçanlar Ballman'ın kafesine konduktan yaklaşık 3 saat sonra 6 saat boyunca sürekli derin anestezi elde etmek için aynı dozda eklenir.</li>
</ol>2. Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDSE) ile lenfosit etiketleme
<ol><li>CFDSE'yi(Malzeme Masası)dimetil sülfit (DMSO) ile 15,6 mM (60 μL DMSO'da çözünmüş 500 μg CFDSE) ile çözün.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi 37 °C'de 30 dakika boyunca50 μLCFDSE çözeltisi ile 50 mL RPMI 1640'ta inkübte lenfositler (1 x 108~10 9).</li>
</ol>3. Mikrovasküler çalışmalar için deneysel kurulum
<ol><li>Alıcı sıçanları (8-12 hafta) Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) ve Betulphar (2,5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun ve anestezinin derinliğini parmak sıkışması ile onaylayın. Saç kirlenmesini en aza indirmek için kürkü tımar etmeden önce karnı ıslatın. Daha sonra alıcı Wister sıçanının karnını orta çizgi kesiğiyle açın.</li>
	<li>Merkezin etrafında cam bir slaytla (24 x 50 mm) kaplı dikdörtgen deliği olan taşınabilir paslanmaz çelik bir plakaya (yaklaşık 120 x 300 mm) bir sıçan koyun. Gözlem için PP'ler de dahil olmak üzere ileal segmentin yaklaşık 10 cm'sini seçin.</li>
	<li>Bağırsağı mümkün olduğunca sıcak tutun ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 37 °C'ye ısıtılır. İnce bağırsağı PBS ile örtmek için kullanılan gazlı bezi ıslatın.</li>
	<li>% 2 izofluran ile sürekli anestezi verirken (bkz. malzeme tablosu), slaytı mikroskop sahnesine koyun ve bazı HEV'lerin serosadan geçtiği PP'lerde mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygun alanları seçin. PEN'lerin boyut aralığı; daha büyük olanlar CLSM kullanarak mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygundur. İnce bağırsak yerlerde düz değildir; herhangi bir gerginlik olmadan en az 2 cm uzunluğunda düz bir segment gözlem için uygundur.</li>
	<li>Bitişik bağırsak segmentini ve mezentery'yi PBS ile ıslatılmış emici pamukla örtün. Bağırsak segmentini iki yuvarlanmış pamuk topu arasına yerleştirin ve sıçanın kalp atışı ve solunumu tarafından titreşmesini önlemek için sıçanın vücudundan mümkün olduğunca uzağa yerleştirin.</li>
	<li>1 mL şırıng kullanarak, alıcı sıçanların şahdamarına cfse etiketli TDL'leri (1 x10 8 hücre) yavaşça enjekte edin. Hızlı bir intravenöz enjeksiyon sistemik dolaşımı etkileyebilir.</li>
</ol>4. Lenfositlerin mikrositülasyonu
<ol><li>CLSM kullanarak PP'lerin mikrovaskülatındaki TDL'leri sürekli izleyin ve 30 s aralıklarla hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanarak bir bilgisayarda 3 saat boyunca kayıt yaptırın. Serosadan PP'lerin HEV'sine kadar olan derinlik yaklaşık 25 μm'dir ve stroma ve kılcal lenf damarlarının 30 μm derinliğe kadar gözlemlenmesine olanak tanır.</li>
	<li>Kan dolaşımını lekelamak için her alıcı sıçanın şahdamarına Texas Red-dektran (25 mg/kg) ve hücre çekirdeğini lekelamak için Hoechest 33342 (5 mg/kg) enjekte edin.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Lenfosit dinamiklerini ölçmek için, HEV'lere bağlı kalan lenfositleri 30 saniyeden fazla "yapışkan lenfositler" ve HEV'lerden stroma'ya göç eden lenfositleri ''lenfositler' olarak tanımlayın. Daha sonra görme alanı başına ortalama göç yüzdesini (göç eden lenfositler / yapışkan lenfositler + göç eden lenfositler) hesaplayın (yaklaşık 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada naif gut-tropik lenfositlerin toplanması ve sıçan PP'lerinde göçlerinin gözlemlenmesi için bir protokol tanımladık. Bu prosedürler, lenfositlerin PP'lerin mikrovaskülürinde nasıl hareket ettiğini ortaya getirebilir ve dinamiklerini normal veya ilaçlı bir durum altında görsel olarak karşılaştırmayı mümkün kılabilir. Gözlem süresi sadece birkaç saatle sınırlı olmasına rağmen, bu dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi, bazı ilaçlar tarafından immünolojik modifikasyon için bir ipu...

Peyer'in yamaları (PP'ler) ince bağırsağın lamina propriasında yüzlerce lenfoid folikülden oluşur. PP'ler foliküllere, foliküller bölgeye ve lenfositlerin antijen sunumu ile uyarıldığı foliküllerin alt kısmında bulunan germinal merkezlere ayrılır. Farklı lenfatik damarlar yoktur ve antijenler epitel hücre tabakası yoluyla bağırsak lümeninden lamina propriasını istila eder. Lenfoid folikülleri kapsayan epitel bölgesine, özel serpiştirilmiş M hücrelerinin mukozal antijenleri aldığı folikül ilişkili epitel denir. M hücreleri luminal taraftan antijenleri alır ve antijenler daha sonra dendritik hücreler tarafından yakalanır ve yüksek endotel venules (HEV' ler) endotel yoluyla PP'lere akan naif lenfositlere doğru sunulur1. PP'ler bağırsak bağışıklığında önemli bir rol oynar ve iltihabın erken evresi ile ilgilidir. Birçok moleküler etkileşim, lenfositlerin yapışma molekülleri, kemokinler 2,3ve sphingosine-1-fosfat4dahil olmak üzereikincil lenfoid organlara (SLO' lar) girişini içerir; bu nedenle, beklenen birçok terapötik hedef vardır. Bu nedenle, PP'lerdeki lenfosit dinamiklerini gözlemlemek, iltihabın çok erken aşamasına bir göz atmamızı ve umut verici birkaç ilacın yararlılığını incelememizi sağlar.
Buradaki yöntem, PP'lerde lenfositlerin göçüne odaklanır, bu da çeşitli prosedürleri içerir (torasik kanal5'e öykünme ve lenfositlerin toplanması ve toplanan lenfositlere enjeksiyondan sonra uzun süreli gözlem). Bu prosedürler karmaşık olduğundan ve önceki raporlarda her prosedürün tam olarak nasıl yapıldığını görmek zor olduğundan, başarılı bir gözlem elde etmek için burada bazı ipuçlarından bahsettik. Örneğin, tüplerin torasik kanala girebilmesi çok zordu ve ilk başarı oranı% 50'den azdı. Bununla birlikte, yöntemi geliştirdik ve% 80'i aşan bir başarı oranı elde ettik. Bu yazıda, lenfositlerin transendotelit göçünün çeşitli koşullar altında nicel olarak değerlendirilmesini sağlamak için başarılı gözlem için gerekli olan diğer bazı ipuçlarından bahsetmiştir.
Önceki raporlarda, PPs6'nındamar yapısını leke etmek için Hindistan mürekkebinin intravenöz enjeksiyonu veya mikroskop monofokal7gibi zamandaki üç boyutlu değişiklikleri anlamak zordu. Son yıllarda, Kaede fareleri gibi bazı foto-dönüşümlü floresan protein transgenik hayvanlar kullanılarak gözlemsel bir yöntem, sistematik hücresel hareketleri netleştirdi vivo8. Diğer çalışma, CD69 lenfosit çıkışlarının PPs9'danbağımsız olarak kapatılmasını açıklığa kavuşturdu. Yüksek analitik özelliği nedeniyle konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) kullandık. Artık yüksek çözünürlüklü görüntüleri kolayca elde edebilir ve lenfosit dinamiklerini analiz etmek için kullanabiliriz.
Bu olguda PP'lerde lenfosit göçünün değerlendirilmesi için bir dizi yöntem gösterilmiştir. İlk olarak, lenfositleri toplamak için torasik kanal cannülasyonunun rafine yöntemlerini gösterdik. İkinci olarak, gözlemsel yöntemleri mikroskobik gözlem altında mümkün olduğunda objektif organları korumak için çeşitli şekillerde geliştirdik ve 3 saat boyunca yüksek kaliteli görüntüler elde etmemizi sağladık. Üçüncü olarak, bazı ilaçların etkilerini değerlendirmek için lenfosit göçünün hücresel hareketlerini ölçtük. Bu değiştirilmiş protokoller mukozal immünoloji değerlendirmelerinin geliştirilmesine katkıda bulunacaktır.

<table><tbody><tr><td>A1R+</td><td>Nikon</td><td></td><td>Comfocal Laser Scanning Microscopy</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>GIBCO</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red&amp;ndash;dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1863</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Naif lenfositler fizyolojik durum altında kandan lenfoid dokulara sirkülasyon yapar ve genellikle bağırsak bağışıklığında önemli bir fenomen olarak kabul edilir. Peyer yamaları (PP'ler) veya mezenterik lenf düğümleri gibi ikincil lenfoid organların stroma'sı, naif lenfositlerin antijenleri algıladığı yerdir. Naif lenfositler, PP'lere giriş portalı olan yüksek endotel venule'lere ulaşmak için kan dolaşımında dolaşır. Bazı immünomodülatörlerin lenfosit göçini etkilediği tahmin edilmektedir, ancak mikrositülasyon dinamiklerinin kesin olarak değerlendirilmesi çok zordur ve lenfosit göçini in vivo olarak gözlemlemek için bir yöntem oluşturmak kesin mekanizmaların netleşmesine katkıda bulunabilir. Lenf kanalından lenfosit toplama ve sıçan PP'lerindeki bağırsak-tropik lenfositlerin ayrıntılı dinamiklerini gözlemleme yöntemini iyileştirdik. Fare PP'lerini in vivo olarak gözlemlemek için konfokal lazer tarama mikroskopisini seçtik ve zaman atlamalı fotoğrafçılık kullanarak kaydettik. Artık lenfosit dinamiklerinin analizine katkıda bulunabilecek net görüntüler elde edebiliriz.

Lenfositlerin lenfositlerden toplanması Sıçanı torasik kanal cannülasyonuna hazırlamak için, Şekil 1'de gösterildiği gibi gergin torasik kanala bir kesi yapın ve daha sonra sıçanı Şekil 2'degösterildiği gibi bir Bollman'ın kafesinde muhafaza edin.
Lenfositler iyi toplandığında, yaklaşık 107~ 10 8 / mL lenfosit içeren yaklaşık 20 mL /6h lenf sıvısı elde edebiliriz. ...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches at JoVE.com

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

microscopic-observation-of-lymphocyte-dynamics-in-rat-peyer-s-patches

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K Görüntüleme.  National Defense Medical College. Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Video: Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Kanser Araştırmaları

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

B Lenfosit Aktivasyonunu Incelemek Için Çekiş Kuvveti Mikroskobu

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Biyomühendislik

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Biyoloji

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer&#39;s Patch

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58490">Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s Patches.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate the isolation of lymphocytes from a harvested mouse Peyer&#39;s patch. The isolated lymphocytes can be used for further analysis.

Bir Fare Peyer Yamasından Lenfositlerin İzolasyonu

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s ...