이 연구는 국방의과 대학의 보조금과 일본 보건복지부의 난치성 질병에 대한 연구를 위한 보건 노동과학 연구 보조금에 의해 지원되었습니다.

실험 프로토콜은 국방 의과 대학의 동물 연구위원회 (No. 16058)에 의해 승인되었다. 동물은 표준 실험실 차우 (CLEA Japan Inc., 도쿄, 일본)에 유지되었습니다. 실험실 동물은 건강의 국가 학회 지침에 따라 취급되었습니다.
1. 림프구의 수집 및 분리
참고: 림프구는 신선해야 하고 저장할 수 없으므로 각 실험에 대해 쥐에서 수집해야 합니다. 또한, 창 자-열대 림프 구체는 순환 흉부 덕트에서 직접 수집 해야 합니다. 모든 절차는 6시간 이내에 완료될 것으로 예상되며 모든 계측기, 장갑 및 표면은 깨끗합니다. 동물을 생리적으로 안정된 상태로 유지하기 위해서는 실험에 사용되는 모든 식염수 및 기타 유체를 따뜻하게 유지해야 합니다.
<ol><li>뜨거운 물(약 80~90°C)에 담근 후 헤파린 곡선(반경 약 5mm)과 같은 캐너레이션 튜브(1mm 직경)를 형성하고 몇 시간 전에 접착제 테이프를 사용하여 플라스틱 보드에 고정합니다.</li>
	<li>미다졸람(2mg/kg), 도미토르(0.15mg/kg), 베툴파르(2.5mg/kg)의 혼합물을 관성 주사로 남성 위스타 쥐(8-12주)를 마취시키고 모발 클리퍼를 사용하여 복부의 체모를 자른다. 모발이 복강에 들어가지 않도록 면도 후 모발을 단단히 제거합니다.</li>
	<li>절차에 필요한 마취의 안정적인 깊이가 발가락 핀치에 의해 얻어진다는 것을 확인한 후, 중간선에서 왼쪽 하위 부위까지 수평으로 수술 가위를 절개합니다. 경상부 혈관을 보면서 정수리 성 관음의 혈관을 손상시키지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>젖은 거즈로 위를 감싸고 위장을 몸 의 오른쪽 바깥쪽으로 부드럽게 움직여 회복 기관을 드러냅니다. 척추의 발기 근육과 수술 가위를 사용하여 지방 조직 사이에 노치를 삽입하고 손가락으로 무뚝뚝하게 분리하십시오.</li>
	<li>흉부 덕트 주변의 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 과잉 결합 조직은 나이에 따라 증가합니다. 흉부 덕트의 길이가 20mm까지 소뚜럼의 왼쪽 십자군 바로 아래에서 흉부 덕트를 노출시합니다. 정밀 핀셋 또는 습식 면 면봉을 사용하여 흉부 덕트와 대어 사이에 부드럽게 접착력을 분리합니다.<ol>
<li>일부 쥐는 심혈 신경총의 높은 위치 (거미줄처럼 확산 작은 흉부 덕트)의 높은 위치로 인해 흉부 덕트 또는 짧은 흉부 덕트를 통해 교차 복부 동맥에서 분기 동맥이 있기 때문에 신중하게이 과정을 수행. 부종을 유도하지 않으려면 흉부 덕트에 불필요한 접촉을 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다이어프램의 왼쪽 십자군 바로 아래에 있는 흉부 덕트에 스트링(3-0 실크)으로 합자를 적용합니다. caudal 흉부 덕트가 비하됩니다.</li>
	<li>외과 가위의 절삭날을 찔러 복부 벽에 구멍(직경 5mm)을 만들고, 헤어핀 곡선 캐니밍 튜브를 통과하고, 한 지점에서 일리오피아 근육에 튜브를 리게이트합니다. 10 U/mL 헤파린을 포함하는 일반 식염수로 캐닝 튜브를 채웁니다.</li>
	<li>연재된 흉부 덕트 아래에 끈(3-0 실크)을 놓은 후, 캐뉼레이션 튜브의 날카로운 절단 가장자리로 흉부 덕트를 찌르고, 꼬리쪽으로 약 5mm를 향하게 하고, 흉부 덕트를 고정용 캐뉼레이션 튜브로 리게이트한다.</li>
	<li>탈수를 방지하기 위해 식염수를 공급하려면 정밀 핀셋을 사용하여 위 안트럼의 전방 벽에 구멍 (직경 3mm)을 만들고 실리콘 튜브 (직경 2mm)를 유로 반지를 통해 십이지장에게 전달합니다. 상처를 바느질하고 Bollman의 케이지에서 동물을 유지 한 후, 3 mL / h의 유속으로 실리콘 튜브에서 각 쥐의 십이지장에 설탕이 함유 된 식염수를 주입하기 시작합니다. 케이지 전체를 종이 타월로 덮어 따뜻하게 유지합니다.</li>
	<li>6 U/mL 헤파린, 10% 태아 소 혈청, RPMI 1640 배지(pH 7.4; 재료 표 참조)를 포함하는 얼음에 50mL 원추형 튜브의 뚜껑의 중앙에 있는 구멍에 캐닝 튜브를 고정하고, 얼음에 흉부 덕트 림프구(TDL)를 수집한다. 튜브 내부의 피브린 응고 형성으로 인한 칸누라기 튜브 폐색을 방지하기 위해 원문 관의 벽에 튜브의 끝을 접촉하지 않도록주의하십시오. 림프액(약 20mL)은 약 1.0x 10 8~109림프구를 6시간 안에 얻을 수 있다. 완전한 마취 하에 림프구를 얻기 위해 마취 평면을 모니터링하고 림프 흐름이 적절하게 관찰됩니다. 동일한 마취제는 쥐가 6 시간 동안 지속적으로 깊은 마취를 얻기 위해 발만의 케이지에 넣은 후 약 3 시간 동안 동일한 용량으로 첨가됩니다.</li>
</ol>2. 카복시플루오레세인 디아세테이트 succinimidyl 에스테르 (CFDSE)와 림프구 라벨
<ol><li>디메틸 설프산화물(DMSO)에서 15.6mM(500μg의 CFDSE가 DMSO의 60 μL로 용해됨)에 CFDSE(재료표)를 용해한다.</li>
	<li>RPMI1640의 50mL에서 37°C에서 37°C에서 30분 동안 30분 동안 림프구(1 x 108~109)를배양한다.</li>
</ol>3. 미세 혈관 연구를위한 실험 용 설정
<ol><li>미다졸람(2mg/kg), 도미토르(0.15mg/kg), 베툴파르(2.5mg/kg)의 혼합물을 관성 주사로 주사하고 발가락 핀치에 의한 마취 깊이를 확인한다. 모발 오염을 최소화하기 위해 모피를 손질하기 전에 복부를 적십니다. 그런 다음 중간 절개를 통해 받는 위스터 쥐의 복부를 엽니다.</li>
	<li>휴대용 스테인리스 스틸 플레이트(약 120 x 300mm)에 쥐를 놓고 중앙 주변에 직사각형 구멍이 유리 슬라이드(24 x 50mm)로 덮여 있습니다. 관찰을 위해 PP를 포함하여 일체 세그먼트의 약 10cm를 선택합니다.</li>
	<li>내장을 가능한 한 따뜻하게 유지하고 인산완충식염(PBS)을 37°C로 데워 보세요. PBS로 소장을 커버하는 데 사용되는 거즈를 담그십시오.</li>
	<li>2 % 이소플루란 (재료의 표 참조)와 연속 마취를 제공하면서, 현미경의 단계에 슬라이드를 넣어 일부 HEV가 세로사를 통해 실행되는 PP에서 미세 순환의 관찰에 적합한 영역을 선택합니다. P의 크기; 더 큰 것들은 CLSM을 사용하여 미세 순환의 관찰에 적합합니다. 소장은 장소에서 똑바로 하지 않습니다. 장력 없이 길이가 2cm 이상 인 직선 세그먼트는 관찰에 적합합니다.</li>
	<li>PBS에 담근 흡수성 면으로 인접한 장 세그먼트와 장간을 덮습니다. 내장 세그먼트를 두 개의 압연 면공 사이에 놓고 쥐의 심장 박동과 호흡에 의해 진동되는 것을 방지하기 위해 쥐의 몸에서 가능한 한 멀리 배치합니다.</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용하여, 천천히 주입 (이상 1 분) CFSE 라벨 TDL (1 x 108 세포) 받는 사람 쥐의 경정맥에. 급속한 정맥 주사는 전신 순환에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
</ol>4. 림프구의 미세 순환
<ol><li>CLSM을 사용하여 PPs의 미세 혈관에서 TDL을 지속적으로 모니터링하고 30대 간격으로 타임랩스 사진을 사용하여 3시간 동안 컴퓨터에 기록합니다. PP의 HEV에 세로사에서 깊이는 약 25 μm, 30 μm의 깊이에 스트로마와 모세관 림프관의 관찰을 가능하게.</li>
	<li>텍사스 레드-dextran (25 mg/kg)을 각 수신자 쥐의 경정맥에 주입하여 혈류를 얼룩지게 하고 Hoechest 33342 (5 mg/kg)를 세포 핵을 얼룩지게합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 림프구 역학을 정량화하기 위해 30초 이상 HEV에 대한 림프구를 "접착제 림프구"로 정의하고 HEV에서 기마로 이동하는 림프구를 '이동 림프구'로 정의합니다. 그런 다음 시야당 이동(림프구/접착제 림프구 마이그레이션 + 림프구 마이그레이션)의 평균 백분율을 계산합니다(약 0.3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

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여기에서 우리는 순진한 창자 열대 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서그들의 이주를 관찰하기위한 프로토콜을 설명했다. 이 절차는 림프구가 PPs의 microvasculature에서 어떻게 움직이는지 밝히고 정상 또는 약용 조건하에서 그들의 역학을 시각적으로 비교하는 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 역학의 직접적인 관찰은 관측 기간이 불과 몇 시간으로 제한되지만 일부 약물에 의한 면역 학적 수정에 대한 ?...

Peyer의 패치 (PPs)는 소장의 라미나 프로프리아에 있는 림프성 여포의 수백으로 이루어져 있습니다. PPs는 여포, 간 간 지역 및 항원 프리젠 테이션에 의해 림프구가 자극되는 여포의 하부에 위치한 발아 센터로 나뉩니다. 포신성 림프관이 없으며 항원들은 상피 세포 층을 통해 장 루멘에서 라미나 프로프리아를 침범합니다. 림프모를 포함하는 상피 영역은 모낭 관련 상피라고하며, 그 내에서 전문화된 M 세포가 점막 항원들을 섭취합니다. M 세포는 발광측과 항원으로부터 항원에서 항원에서 복용한 다음 수지상 세포에 의해 포획되고 높은 내피 정맥(HEV)의 내피성 정맥을 통해 PPs로 흐르는 순진한 림프구를 향해제시된다. PPs는 장 면역에 있는 중요한 역할을 하고 염증의 초기 단계와 관련있습니다. 많은 분자 상호 작용은 접착 분자, 케모키인2,3및스핑고신-1-인산염4를포함하여 이차 림프구 기관(STO)에 림프구의 입구를 포함합니다. 따라서, 많은 예상 된 치료 대상이 있다. 따라서, PPs 내의 림프구 역학을 관찰하면 염증의 초기 단계를 엿볼 수 있으며 여러 유망한 약물의 유용성을 검사 할 수 있습니다.
여기서 방법은 여러 절차 (흉부 덕트5로 의 통조림 및 수집 된 림프구로 주입 한 후 림프구 및 장기 관찰을 수집)를 포함하는 PPs에서 림프구의 이동에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 절차는 복잡하고 이전 보고서에서 각 절차가 수행된 방법을 정확하게 확인하기 가 어려웠기 때문에 성공적인 관찰을 달성하기 위한 몇 가지 팁을 여기에서 언급했습니다. 예를 들어, 흉부 덕트로 튜브의 캐니언은 매우 어려웠으며, 캐너레이션의 초기 성공률은 50% 미만이었습니다. 그러나, 우리는 방법을 개선하고 80 %를 초과하는 성공률을 달성했다. 우리는 여러 조건하에서 림프구의 경전 적 이동의 정량적 평가를 가능하게 하기 위하여 성공적인 관측을 위해 필요한 이 원고에 있는 몇몇 다른 팁을 언급했습니다.
이전 보고서에서는, PPs6의혈관 구조를 얼룩지게 하기 위해 인도 잉크의 정맥 주사와 같은 시간이 지남에 따라 3차원 변화를 이해하기 어려웠다, 또는 현미경은 단일 초점7인. 최근에는 Kaede 마우스와 같은 일부 광변환형 형광 단백질 트랜스제닉 동물을 이용한 관측 방법이 생체 내에서 체계적인 세포 움직임을 명확히하였다 8. 다른 연구는 PPs9에서림프구 송구의 CD69 독립적 인 종료를 명확히. 우리는 높은 분석 기능 때문에 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)를 사용했습니다. 이제 우리는 쉽게 고해상도 이미지를 얻고 림프구 역학을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
이 보고서에서는 PP에서 림프구 마이그레이션을 평가하는 일련의 방법을 시연했습니다. 첫째, 우리는 림프구를 수집하기 위해 흉부 덕트 캐너레이션의 세련된 방법을 보여 주었다. 둘째, 현미경 관찰하에 가능한 한 객관적인 장기를 유지하는 여러 가지 방법으로 관찰 방법을 개선하여 3시간 동안 고품질 이미지를 얻을 수 있게 했습니다. 셋째, 림프구 이동의 세포 움직임을 정량화하여 일부 약물의 효과를 평가했습니다. 이러한 수정된 프로토콜은 점막 면역학 평가의 발달에 기여할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>A1R+</td><td>Nikon</td><td></td><td>Comfocal Laser Scanning Microscopy</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>GIBCO</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red&amp;ndash;dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1863</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

순진한 림프구는 생리적인 조건 하에서 림프구에 혈액에서 재순환하고 일반적으로 창 자 면역에 중요 한 현상으로 인식. Peyer의 패치 (PPs) 또는 막질 림프절과 같은 이차 림프구의 기질은 순진한 림프구가 항원을 감지하는 곳입니다. 순진한 림프구는 높은 내피 정맥, PPs에 입력의 포털에 도달하기 위해 혈류를 통해 순환. 일부 면역 조절기는 림프구 이동에 영향을 미치는 것으로 추정되지만, 미세 순환 역학의 정밀한 평가는 매우 어렵고 생체 내에서 림프구 이동을 관찰하는 방법을 확립하는 것은 정밀한 메커니즘의 해명에 기여할 수 있다. 우리는 림프덕에서 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서 장 열대 림프구의 상세한 역학을 관찰하는 방법을 정제했습니다. 우리는 생체 내에서 쥐 P를 관찰하기 위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사를 선택하고 시간 경과 사진을 사용하여 기록했습니다. 이제 림프구 역학 분석에 기여할 수 있는 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.

림프에서 림프구 수집 흉부 덕트 캐넌션에 대한 쥐를 준비하려면 도 1에 표시된 것처럼 긴장된 흉부 덕트에서 절개를 한 다음 도 2에표시된 볼만의 케이지에서 쥐를 유지한다.
림프구가 잘 수집되면 약 20mL/6 h 림프액을 약 10 7~108/mL 림프구를 얻을 수 있습니다. TL 중 70%는 CD4를 발현하며, 그 중 약 90%의 ...

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.

쥐 페이어의 패치에서 림프구 역학의 현미경 관찰

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

microscopic-observation-of-lymphocyte-dynamics-in-rat-peyer-s-patches

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K 조회수.  National Defense Medical College. 여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.

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Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

연구

면역학 및 감염병학

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

암 연구학

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

B 림프구 활성화를 연구하는 견인력 현미경 검사법

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

생체공학

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

생물학

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer&#39;s Patch

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58490">Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s Patches.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate the isolation of lymphocytes from a harvested mouse Peyer&#39;s patch. The isolated lymphocytes can be used for further analysis.

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer's Patch

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s ...