Bu protokol, trans-spinal doğrudan akım stimülasyonunun spinal ağların işlevi üzerindeki etkisini doğrudan araştırmak için spinal motoneuronların hücre içi kayıtlarını kullanır. Bu tekniğin en büyük avantajı hücre içi kayıtların tamamen olgun sinir sisteminde yapılmasına izin verilmesidir. Deneysel gözlemlerin pratik uygulamalara çevrilmesini kolaylaştırmak.
Pedal refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, anestezi altı aylık erkek Wistar sıçan, bir diseksiyon mikroskop ve bir numara 21 bıçak kullanın, sternum çeneye uzunlamasına deri kesi yapmak için. Ve sağ juguler ven ortaya çıkarmak için künt diseksiyon kullanın. Dallanma noktaları olmadan damar bölümü altında iki, 4-0 ligatures yerleştirin.
Ve damar segmentinin proksimal ucunda gevşek bir düğüm olun. Ve segmentin distal ucunda gevşek bir düğüm. Kalbe damar proksimal kelepçe ve ven distal ucunu ligate.
Kıskaç ve distal ligature arasında bir kesi yapmak için iris makas kullanın. Ve, damar bir flep tutarak, damar kelepçe tarafından bloke noktasına önceden doldurulmuş bir kateter tanıtmak. Sonra kelepçeyi çıkarın ve kateteri birkaç milimetre lik bir damara doğru itin.
Trakeal tüp yerleştirme için, sternohyoid kasları kapsayan iki mandibular bezleri ayırmak için künt forseps kullanın. Ve trakeayı ortaya çıkarmak için orta hattaki sternohyoid kasları ayırın. Trakeanın altına üç, 4-0 ligatürler yerleştirin ve trakeal tüp ekleme noktasının altına iki düğüm ve bir düğüm yukarıda.
Sonra üçüncü trakeal kıkırdak altında trakea içine bir trakeal tüp takın. Ve tüpü önceden hazırlanmış bağlarla sabitle. Arka ekstremite sinirlerini incelemek için, aşil tendonundan kalçaya kadar sol arka ekstremitenin arka tarafında uzunlamasına bir kesik yapmak için 21 numaralı bıçak kullanın.
Ve diz ekleminin arkasında popliteal fossa ön ve arka bölgeleri arasında bir kesim yapmak için makas kullanın. Siyatik siniri ortaya çıkarmak için biceps femoris iki baş kesti. Ve tibial sinir ve dalları ortaya çıkarmak için, gastroknemius kas medial başkanı lateral başkanı ayırın.
Sonra medial gastroknemius ve lateral gastroknemius ve soleus sinirleri dikkatlice incelemek için, 55 numara forceps kullanın. Kasların ilgili bağlantılarını korurken çevredeki dokulardan kopukluk. Laminektomi yapmak için, sakrumdan torasik vertebraya kadar uzunlamasına bir kesi yapmak için 21 numaralı bıçak kullanın.
Ve Th13 omurunu kaburga takılması ile en düşük torasik segment olarak tanımlayın. Sonra spinous süreçleri kaldırmak için ince rongeurs kullanın ve L2 vertebra Th13 laminae, omurilik lomber segmentleri ortaya çıkarmak için. Vertebral sütun düzeltmek için, kapalı bir döngü ısıtma sistemine bağlı bir 37 derece Santigrat ısıtma yastığı üzerinde özel bir yapılmış çerçeve içine sıçan yerleştirin.
Ve deri fleplerini kullanarak açıkta kalan omuriliğin üzerinde derin bir havuz oluştur. Metal kelepçeleri Th12 enine proseslerinin altına ve L3 spinous proseslerine yerleştirin ve havuzu 37 santigrat derece mineral yağla doldurun. Maruz kaval, medial gastroknemius ve lateral gastroknemius ve soleus sinirler üzerinde mineral yağ derin bir havuz yapmak için deri flepleri kullanın.
Ve sinirleri bipolar gümüş tel uyarıcı elektrotlar üzerine yerleştirin. Sonra her sinir için ayrı stimülasyon kanalları kullanarak bir kare darbe uyarıcı elektrotlar bağlayın. Bir yüzey elektrot yerleştirme için, diseksiyon mikroskobu altında, maruz kalan omuriliğin sol kaudal tarafına gümüş bir top elektrot yerleştirin.
Sırt kaslarında bir referans elektrot takılı. Ve her iki elektrotu da diferansiyel DC amplifikatöre bağlayın. Medial gastroknemius ve lateral gastroknemius ve soleus sinirleri uyarmak için sabit bir akım uyarıcı kullanın, bir kare darbeler ile 0.1 milisaniye süre üç hertz frekansta tekrarlanan ve afferent voleleri gözlemlemek.
Simülasyonun sonunda, yüzey elektrot rostrally hareket ve vole genlikleri her sinir için en yüksek olduğu spinal segmentleri belirlemek için stimülasyon tekrarlayın. Maksimum vole yerini belirledikten sonra, sıçan felç etmek için intravenöz bir nöromüsküler bloker teslim. Bir asistan trakeal tüpü kemirgen uyumlu kapak nominator doğrultusunda harici bir ventilatöre bağlariken.
Dura ve pia mater'ı açmak için, dura mater'i nazikçe kaldırmak için 55 numaralı forseps kullanın ve l5 segmentinden l4 segmentine kadar olan dokuyu caudally kesin. Sonra ultra ince 5SF forceps bir çift kullanın, pia küçük bir yama yapmak için, kan damarları arasında dorsal sütun kapsayan. Tam olarak medial gastroknemius ve lateral gastroknemius ve soleus sinir maksimum afferent vole düzeyinde.
Trans-spinal doğrudan akım stimülasyon elektrotları yerleştirmek için, Th12 vertebra sırt tarafında bir tuzlu ıslatılmış sünger yerleştirin. Ve aktif bir trans-spinal doğrudan akım stimülasyon elektrot ile sünger basın için ince manipülasyon kullanın. Sonra mikro manipülatör üzerine özel bir havuzlu mikroelektrot monte, bir ila iki mikron adım hareketi ve stereotaksik kalibrasyon sağlayan.
Ve pia seçilen bir yama içine bir mikropipet ucu sürücü, bir 15-20 derece medial lateral açı. Motoneuron membran ve ateşleme özellikleri kaydetmek için, hücre içi amplifikatör köprü modunda, antidromik eylem potansiyelinin tüm ya da hiçbir görünüm temelinde motoneuron tanımlamak için ilgili sinir dalları teşvik. Mevcut anahtar hızı modu dört ila sekiz kilohertz ile hücre içi amplifikatör sürekli akım kelepçe modunda, bir ortodontik eylem potansiyeli uyandırmak için, bir 0.5 milisaniye hücre içi hücre içi depolarize akım darbeleri kullanın, motoneuron bir ortodontik eylem potansiyeli uyandırmak için.
Hücre giriş direncini hesaplamak için, bir nanogram akımıhiperpolarize 40 kısa 100 milisaniye darbeler ile, bir motoneuron uyarmak. Tek bir başak ortaya çıkarmak için gerekli depolarize akımın minimum genlik olarak gerçek baz değerini belirlemek için, artan genliklerde 50 milisaniyekare dalga darbeleri ile bir motoneuron teşvik. Sonra artan genliklerde, depolarize akım 500 milisaniyekare dalga darbeleri enjekte.
0.1-iki nano amper adım, motoneurons ritmik deşarj uyandırmak için. Bir trans-spinal doğru akım stimülasyon için, doğru akım trans-spinal uygulama ile polarizasyon prosedürleri başlatmak, motoneuron istikrarlı bir penetrasyon korurken. Burada, tipik bir ortotropik etki potansiyeli, veri dahil etmek için tüm kriterleri karşılayan hücre içi stimülasyon tarafından uyarılmış gösterilir.
Bu analizde, bir nanogramın 100 milisaniyelik hiperpolarize akım darbesine bir hücre yanıtı. Bir motoneuronun hem tepe hem de plato giriş direnci, gerilim sapmasından belirlenebilir, gözlemlenebilir. Gerçek bir temel başak bu genişletilmiş gerilim izi, başak bir açıkça işaretlenmiş voltaj eşiği sergiler.
Etki potansiyelini başlatmak için voltaj kapılı sodyum kanallarının aktive edildiği membran depolarizasyon seviyesini gösteren. Bu grafikler hücre içi gerilim izlerinin örneklerini sağlar. İki motoneurons itibaren, depolarize akım 500 milisaniyelik kare darbeler ile hücre içi uyarılmış.
Önce, sırasında ve bir trans-spinal doğrudan akım stimülasyon uygulaması sonra. Anodal trans-spinal doğru akım stimülasyonu nun artmış motonöron uyarılabilirliği ve ritmik ateşleme sıklığının artması yönünde hareket olduğu bulunmuştur. Kahodal trans-spinal doğru akım stimülasyon iken, inhibisyon ateş doğru hareket etti.
Ayrıca, trans-spinal doğru akım stimülasyon her iki tip etkileri, polarizasyon dönemi dayandı. Eksik hücre penetrasyonu nedeniyle veri ekleme kriterleri tehlikeye girerse, yanlış veri elde edilebilir. Mikroelektrot direncive kapasitans veya omurilik dengesizliğini telafi etmedeki bir başarısızlık.
Yaralanma omurilik şokuna yol açabileceğinden, diseksiyon sırasında omurilikte herhangi bir hasar olmaması zorunludur, bu da daha fazla kaydı imkansız hale getirir. Daha fazla histolojik veya immün sito kimyasal analiz için doku örnekleri hasat mümkündür. Örneğin, c-fos ekspresyonunun ölçümü nöronal aktivitenin bir proxy'si olarak kullanılabilir.
