פרוטוקול זה משתמש בהקלטות תאיות של motoneurons עמוד השדרה, כדי לחקור ישירות את ההשפעה של גירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה על הפונקציה של רשתות עמוד השדרה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הקלטות תאיים להתבצע על מערכת העצבים בוגרת לחלוטין. הקלת תרגום התצפיות הניסיוניות ליישומים מעשיים.
לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, חולדת Wistar זכר הרדמה בן שישה חודשים, להשתמש במיקרוסקופ ניתוח להב מספר 21, כדי להפוך חתך בעור האורך מעצם החזה לסנטר. ולהשתמש ניתוח קהה כדי לחשוף את וריד הצוואר הימני. מניחים שתיים, 4-0 ליגטורות מתחת לקטע של וריד ללא נקודות הסתעפות.
ולעשות קשר רופף אחד בקצה הפרוקסימלי של קטע הורידים. וקשר רופף אחד בקצה הדיסטלי של הקטע. מהדקים את הוריד קרוב ללב, וממליים את הקצה הדיסטלי של הוריד.
השתמש מספריים איריס לעשות חתך בין המהדק ואת קשירה דיסטלית. בנוסף, מחזיק דש של וריד, להציג קטטר מלא מראש עד לנקודה שבה וריד נחסם על ידי המהדק. לאחר מכן להסיר את המהדק ולדחוף את הקטטר כמה מילימטרים לתוך הוריד.
למיקום צינור קנה הנשימה, השתמש במקלות קהות כדי להפריד בין שתי בלוטות התיחב המכסות את שרירי הסטרוהיאידים. ולהפריד את שרירי השטרנוהיואידים בקו האמצע, כדי לחשוף את קנה הנשימה. מניחים שלוש, 4-0 ליגטורות מתחת קנה הנשימה, ולעשות שני קשרים מתחת לנקודת החדרת צינור קנה הנשימה וקשר אחד מעל.
ואז להכניס צינור קנה הנשימה לתוך קנה הנשימה מתחת לסחוס קנה הנשימה השלישי. ולאבטח את הצינור במקום עם הקשירה המוכנה מראש. כדי לנתח את עצבי הגפיים האחוריות, השתמש בלהב מספר 21 כדי לבצע חתך אורך בצד האחורי של האיבר האחורי השמאלי, מגיד אכילס לירך.
ולהשתמש במספריים כדי לעשות חתך בין האזורים האחוריים והפוטריים של אופוסה popliteal, בחלק האחורי של מפרק הברך. חותכים שני ראשי שרירי הירך, כדי לחשוף את העצב הסיאטי. ולהפריד את הראש מצד שני מן הראש המדיאלי של שריר gastrocnemius, כדי לחשוף את העצב tibial וענפיו.
ואז להשתמש במספר 55 מלקחים, כדי לנתח בזהירות את gastrocnemius המדיאלי ואת עצבי gastrocnemius ו soleus מצד שני. ניתוקם מן הרקמות שמסביב תוך שמירה על הקשר שלהם בהתאמה של השרירים. כדי לבצע את כריתת המעי הגס, השתמש בלהב מספר 21 כדי לבצע חתך אורך מן הסרום עד חוליות בית החזה.
ולזהות את חוליית Th13, כמקטע בית החזה הנמוך ביותר עם החדרת צלעות. לאחר מכן השתמש rongeurs בסדר כדי להסיר את התהליכים ספינוס laminae מן Th13 לחוליות L2, כדי לחשוף את החלקים המותניים של חוט השדרה. כדי לתקן את עמוד החוליות, מקם את החולדה במסגרת מותאמת אישית על משטח חימום של 37 מעלות צלזיוס, המחובר למערכת חימום לולאה סגורה.
ולהשתמש במדפים העור כדי ליצור בריכה עמוקה מעל חוט השדרה החשוף. מניחים מלחצי מתכת מתחת לתהליכים הרוחביים של Th12, ובתהליכים הסיבוביים של L3, וממלאים את הבריכה בשמן מינרלי של 37 מעלות צלזיוס. השתמש במדפים העור כדי להפוך בריכה עמוקה של שמן מינרלי על פני טיביאלי חשוף, גסטרוצנימיוס המדיאלי ו עצבי גסטרוקניוס ו soleus.
ולמקם את העצבים על חוט כסף דו קוטבי מגרה אלקטרודות. לאחר מכן חבר את האלקטרודות לגירוי דופק מרובע באמצעות תעלות גירוי נפרדות לכל עצב. עבור מיקום אלקטרודה פני השטח, תחת מיקרוסקופ ניתוח, מניחים אלקטרודה כדור כסף בצד השמאלי caudal של חוט השדרה החשוף.
עם אלקטרודה התייחסות מוכנס בשרירים האחוריים. ולחבר את שתי האלקטרודות למגבר DC דיפרנציאלי. השתמש ממריץ זרם קבוע כדי לעורר את gastrocnemius המדיאלי ו עצבי gastrocnemius ו soleus רוחבי, עם פולסים מרובעים של משך 0.1 אלפית שנייה חוזר בתדר שלושה הרץ ולצפות מטח afferent.
בסוף הסימולציה, להזיז את האלקטרודה פני השטח rostrally, ולחזור על הגירוי כדי לזהות את מקטעי עמוד השדרה שבו משרעת של מטח הם הגבוהים ביותר עבור כל עצב. לאחר קביעת המיקום של מטח מקסימלי, לספק חוסם neuromuscular דרך הווריד כדי לשתק את החולדה. בעוד עוזר מחבר את צינור קנה הנשימה למכונת הנשמה חיצונית בקנה אחד עם מכרסם תואם כובע.
כדי לפתוח את דורה ופיא מאטר, השתמש במספר 55 מדפים כדי להרים בעדינות את הדורא מאטר, וחתוך את הרקמה באופן סיבתי ממקטע L5, עד למקטע L4. לאחר מכן השתמש בזוג מדפים דקים במיוחד של 5SF, כדי ליצור טלאי קטן ב- pia, המכסה את עמוד הגב בין כלי הדם. בדיוק ברמה של מטח afferent המרבי מן gastrocnemius המדיאלי ו gastrocnemius מצדדים ועצב soleus.
כדי למקם את אלקטרודות גירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה, מניחים ספוג ספוג מלוחים בצד הגבי של חוליות Th12. ולהשתמש במניפולציה עדין כדי ללחוץ על הספוג עם אלקטרודה פעילה גירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה. לאחר מכן הרכב מיקרו-אלקטרוד מותאם אישית, על המיקרו מניפולטור, המאפשר תנועת דריכה של מיקרון אחד עד שניים וכיול סטריאוטוקסי.
ולהניע קצה micropipette לתוך תיקון נבחר ב- pia, בזווית 15 עד 20 מעלות המדיאלית. כדי להקליט את קרום motoneuron ואת תכונות הירי, במצב הגשר של מגבר תאיים, לעורר את ענפי העצבים המתאימים לזהות את motoneuron על בסיס המראה כל או כלום, של פוטנציאל פעולה antidromic. במצב מהדק זרם לא רציפ של המגבר תאי עם מצב קצב מתג זרם ארבעה עד שמונה קילוהרץ, להשתמש 0.5 אלפית שנייה דפולרי depolarizing פולסים זרם, כדי לעורר פוטנציאל פעולה אורתודונטית, ב motoneuron.
כדי לחשב את ההתנגדות לקלט התא, לעורר motoneuron, עם 40 קצר 100 אלפיות שנייה פולסים של hyperpolarizing זרם ננוגרם אחד. כדי לקבוע את ערך הבסיס האמיתי כמו משרעת מינימלית של זרם depolarizing הנדרש כדי לעורר ספייק אחד, לעורר motoneuron עם פולסים גל מרובע 50 אלפיות שנייה בהגברת משרעת. ואז להזריק 500 אלפיות שנייה פולסים גל מרובע של זרם depolarizing, בהגברת משרעת.
ב 0.1 כדי שני צעדים ננו אמפר, כדי לעורר הפרשות קצביות של motoneurons. עבור גירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה, להתחיל את הליכי הקיטוב על ידי יישום חוצה עמוד השדרה של זרם ישיר, תוך שמירה על חדירה יציבה של motoneuron. כאן, פוטנציאל פעולה אורתוטרופי טיפוסי, עורר על ידי גירוי תאי העונה על כל הקריטריונים להכללת נתונים מוצג.
בניתוח זה, תגובת תא לפעימה נוכחית היפרפולריזציה של 100 אלפיות השניה של ננוגרם אחד. שממנו ניתן לראות הן את ההתנגדות לקלט הפסגה והן את התנגדות הכניסה לרמה של מוטונורון, מהטיית המתח. זה עקבות מתח מורחב של ספייק בסיסי אמיתי, מציג סף מתח מסומן בבירור של ספייק.
המציין את רמת depolarization קרום שבו תעלות נתרן מגודר מתח מופעלים ליזום את פוטנציאל הפעולה. גרפים אלה מספקים דוגמאות של עקבות מתח תאי. משני motoneurons, מגורה תאית עם 500 אלפיות שנייה פולסים מרובעים של זרם depolarizing.
לפני, במהלך, ואחרי יישום גירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה. נמצא כי גירוי זרם ישיר חוצה עמוד שדרה אנודיאלי פועל לקראת עירור מוטונורון מוגבר ותדרים גבוהים יותר של ירי קצבי. בעוד גירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה קתודאלי, פעל לקראת עיכוב ירי.
יתר על כן, ההשפעות של שני הסוגים של גירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה, שרד את תקופת הקיטוב. ניתן להשיג נתונים לא מדויקים, אם קריטריוני הכללת הנתונים נפגעים עקב חדירת תאים לא מושלמת. כישלון לפצות את ההתנגדות וההתנגדות המיקרו-אלקטרונית או את חוסר היציבות בחוט השדרה.
זה הכרחי כי לא נגרם נזק לחוט השדרה במהלך הניתוח כמו פציעה יכולה לגרום להלם בעמוד השדרה, מה שהופך הקלטות נוספות בלתי אפשרי. ניתן לקצור דגימות רקמה לניתוח כימי היסטולוגי או אימונו ציטו נוסף. לדוגמה, המדידה של ביטוי c-fos יכול לשמש פרוקסי של פעילות עצבית.
