Sinapslar nöronların fonksiyonel elemanları dır ve bunların kusurları veya kayıpları çeşitli nörodejeneratif ve nörolojik bozuklukların temelinde dir. Görüntüleme çalışmaları fizyolojik ve patolojik koşullarda işlevlerini ve plastisitesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyüklükleri ve yapıları nedeniyle proteinlerin lokalizasyon çalışmaları yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerektirir.
Bu protokolde, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu kullanılarak süper çözünürlük düzeyinde sinaptik belirteçlerle hedef proteinlerin birlikte lokalizasyonu nun birincil nöronlarda incelenmesi için bir prosedür tanımlıyoruz. SIM, geniş alan mikroskobunun uzamsal çözünürlüğünü iki katına çıkararak yaklaşık 100 nanometrelik bir detaya ulaşan desenli bir ışık aydınlatma tekniğidir. Protokol, sağlam eş yerelleştirme çalışmaları için gerekli denetimleri ve ayarları ve görüntüleme verilerini doğru analiz etmek için istatistiksel yöntemlere genel bakışı gösterir.
Ancak, süper çözünürlük düzeyinde analize izin vermenin anahtarı, satın alma sırasında kullanılan odacıklı kapaklar ve hedefin kırınım indeksi ile uyumlu montaj çözümleri gibi reaktiflerdir. Bir fare hipokampal birincil nöron elde etmek için, P1 P4 yavruhipokampi izole. Plaka hücreleri 70, kuyu başına 000 hücre kuyu başına 200 mikrolitre lik bir hacimde.
Hipokampal primer nöronlar tamamen olgunlaştı kadar bekleyin 12 için 14 gün sonra ortak lokalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için kaplama. Hızlı bir şekilde düzeltmek için nöronlar için iyi pbs 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit, PFA, ekleyin. Çözeltiyi çıkarın ve numuneleri %1 büyükbaş serum albumini olan BSA ile, PBS'de 200 mikrolitre de oda sıcaklığında bir saat boyunca, analiz için alakasız bir proteinle plakanın serbest ciltli tüm yüzeylerini pasif olarak kaplayın.
Triton X-100 olmadan BSA tabanlı engelleme tamponu, %0,2 Triton X-100 ile aynı tampondan daha verimli bir şekilde antikor arka planını azaltır. Birincil antikor ekleyin. Negatif kontrol olarak, kuyulardan birine herhangi bir birincil antikor eklemeyin.
Sim uyumlu bir montaj antonu kullanarak hücreleri monte edin, örneğin ProLong Glass Antifade Mountant. Kapak ve bir coverglass ile hücreleri korumak, örneğin, sekiz milimetre çapında yuvarlak bir coverglass.
Kare olanlar da kullanılabilir. Odacıklı kapakları oda sıcaklığında saklayın ve görüntü elde etmeden önce en az 48 saat bekleyin. Elmas cam süper çözünürlüklü satın almadan önce kür en az iki gün gerektirir.
Antikor özgüllüğünü sağlamak için iki strateji kullanın. Bunlardan ilki, aynı substratı hedefleyen en az iki farklı antikor kullanımıdır. İkinci strateji saflaştırılmış protein hedefi ile kuluçka ile antikor nötralizasyon, ya da antikor yükseltmek için kullanılan.
Analizlerimiz için Nikon tarafından üretilen N-SIM süper çözünürlüklü bir mikroskobu rutin olarak kullanıyoruz. İzleyen talimatlar, sim görüntülerin mikroskobundan bağımsız olarak elde edilmesi için tasarlanmıştır. Ayrıca, düzeltme halkası, lazer hizalama ve ızgara blok odaklama dahil olmak üzere cihazların doğru bir kalibrasyon gerçekleştirmek için mikroskop performansını en üst düzeye çıkarmak için önemlidir.
SIM görüntülerin edinilmesinden önce, sistem belirli alt çözünürlüklü boyutta floresan boncuklar ile uygun bir kalibrasyon gerektirir. Buna bir örnek TetraSpeck mikrokürelerdir. Bu boncuklar farklı floresan boyalar ile tek bir örnek ile farklı lazerlerin kalibrasyonu sağlamak için boyanmıştır.
Bir su banyosunda, 10 dakika boyunca 8 floresan mikrosferler için 1.8 kat 10 civarında sonicate. Floresan mikrosferleri 500'de bir oranında çift distile suda seyreltin. Ek bir 10 dakika için ikinci kez Sonicate.
Pipet 15 mikrolitre seyreltilmiş boncuklar odalı bir kapak kuyusu içine. Çözelti oda sıcaklığında beş dakika kurutulalım. Montaj çözeltisinin 10 mikrolitresini ekleyin, örneğin.
ProLong Glass ve üstüne sekiz milimetrelik bir kapak kaydırın. Uygun bir kür izin vermek için en az 48 saat bekleyin. Mikroskobu ve lazerleri açın.
Tüm mikroskop bileşenlerinin termal dengesine ulaşmak için sistemin ısınmasına izin verin ve SIM süper çözünürlüklü mikroskop sistemi en az üç saat gerektirir. 100X hedefini seçin. Lazerleri kırınım ızgara bloğunun ortasına hizalayarak kalibrasyonu başlatın.
N-SIM sisteminde, bir mikrometre knob ve özel bir kamera, ışık demetlerinin hedefe ortalanmasına olanak sağlar. Görüntülemek için mikroskobun odacıklı kapak fişini takın. Objektif düzeltme kapağını ayarlayarak sistemi odalı kapak kalınlığına ayarlayın.
N-SIM süper çözünürlüklü mikroskop sistemleri ile sağlanan tescilli yazılım Olan NIS Software, renklerin düzeltilmesini düzenleyen otomatik bir fonksiyona sahiptir. Numune üzerinde odaklanmış yapılandırılmış desen aydınlatması sağlamak için her kanal için ızgara bloğu odağı ayarlayın. Yazılım bu görev için otomatik bir işlev sağlar.
Çok renkli mikrokürelerin ham 3D SIM görüntülerini edinin. Her ayrı dalga boyu için süper çözülmüş görüntünün Fourier dönüşümünü hesaplayın. Dönüştürülmüş görüntü doğru çiçek benzeri bir desen elde edemezse, süper çözünürlük elde edilmediğından kalibrasyonu yeniden başlatın.
Süper çözümlü görüntüde, elde edilen çözünürlüğü ölçmek için tek bir mikrosfer seçin ve her kanal için yoğunluk profilini hesaplayın. Şimdi yanal olarak 100 nanometreye yakın olmalıdır. Mikrokürelerin çok kanallı bir edinimi kaplayarak kanal kaydı gerçekleştirin.
Amaç, tüm kanal sinyallerini yanal ve eksenli olarak harmanlamaktır. Bu, farklı kanalların yanlış hizalanması nedeniyle renk sapmalarını ortadan kaldırır ve birlikte yerelleştirme analizine yardımcı olur. Açık kaynak uygulaması ImageJ için bir eklenti paketi olan SIMcheck'in aydınlatma fazı adımı ve aydınlatma desenli odağı işlevlerini kullanarak kalibrasyon kalitesini onaylayın.
Confocal veya widefield modunda 40X hedefi kullanarak örnek analiz başlayın. Bu, iyi ayrıntı ve geniş bir görüş alanı koruyarak, örneğin gezinme sağlar. Nöronal süreçleri temsil eden bir alanı tespit etmek için MAP2 antikor sinyalini kullanın.
Boyama kalitesini belirlemek için numunenin konfokal modda görüntülerini edinin. Hedef 100X'e geçin. 100X hedefine yağ uygulayın.
Süper çözümlenmiş görüntünün kalitesini değerlendirmek için daha sonra kullanılacak geniş alan veya konfokal görüntü elde edin. 3B SIM moduna geçin. Edinme parametrelerini ayarlamak için diyalog pencerelerini kullanarak, renk bilgilerini en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilen en yüksek bit derinliği ayarını seçin.
Genellikle, 16 bit standart seçimdir. Ayrıca, sinyal-gürültü oranını artırmak için, bir megahertz gibi satın alma için düşük frekanslı bir değer seçin. Histogram pencereleri kullanarak, bilgi kaybını önlemek için doğrusal bir sinyal yanıtı elde etmek için lazer gücü ayarlayın, görüntülerdeki doymuş pikselleri sınırlayın.
N-SIM sistemi Andor iXon3 kamera kullanır. 16 bit'te çalışırken, kameranın doğrusal tepkisini sağlamak için 16.000 hedef yoğunluğu nu seçin. Alternatif olarak, satın almaların dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak için 30,000 ile 45, 000 arasında bir aralık seçin.
Lazer gücünü, numuneleri görüntülerken %0,1 ile %50 arasında, pozlama sürelerini ise 50 milisaniye ile iki saniye arasında ayarlayın. %50'nin üzerindeki lazer güçleri, kullanımdaki floroforların hızlı fotobeyazrlanmasına neden olabilir. Görüntüleri 3B SIM modunda edinmeye başlayın.
Raw görüntülerin satın alma kalitesini değerlendirmek için ImageJ için ücretsiz eklentiler paketi olan SIMcheck'i kullanın. SIMcheck herhangi bir yapı veya kalite sorunu algılamazsa, istatistiksel analize olanak sağlamak için tam teknik kopyalardan en az 10 görüntü elde edin. Edinilen görüntüler, daha fazla analiz için kullanılacak yeniden oluşturulmuş SIM görüntüleri elde etmek için işlenmesi gereken ham verilerdir.
Protokolde sinapsin ve PSD-95'i sinaptik belirteçler öncesi ve sonrası olarak kullanmanızı öneririz. Ancak, ek işaretçiler kullanılabilir. Literatür büyük bir vücut sinaptik belirteçleri olarak drebrin ve fagot gibi diğer proteinlerin kullanımını destekler.
3D SIM edinilmiş görüntüler, yeniden oluşturulmuş süper çözümlü görüntüler elde etmek için işlenmesi gereken ham görüntülerdir. Ham görüntülerin yanlış yeniden yapılandırılması, örneklerin analizini etkileyecek yapılara yol açabilir. Bu nedenle rekonstrüksiyon parametrelerinin doğru şekilde seçilmesi için büyük dikkat edilmelidir.
Süper çözümlenmiş bir görüntü elde etmek için mikroskop rekonstrüksiyon analiz yazılımını kullanarak ham görüntüleri işleyin. Alternatif olarak, ham görüntüleri yeniden oluşturmak için serbestçe kullanılabilir ImageJ eklentifairSIM kullanın. Mikroskop rekonstrüksiyon yazılımı veya ImageJ eklentisi SIMcheck kullanarak süper çözülmüş görüntülerin Fourier dönüşümünü hesaplayın.
İyi bir yeniden oluşturulmuş görüntü, her kanal için, bir çiçek gibi görüntü dönmek gerekir. Yeniden yapılandırılan görüntüler çiçek benzeri bir şekli yeniden oluşturamazsa, ham görüntülerden yeniden başlatın ve doğrusal filtreleme, apodization ve sıfır sıra bastırma gibi yeniden yapılandırma parametrelerini değiştirerek bunları yeniden oluşturun. Parametrelerin değiştirilmesinin son çözümlenmiş görüntüyü nasıl etkilediğini izlemek için önizlemeyi kullanan NIS Yazılımında, parametrenin aydınlatma modülasyonu kontrastını, yüksek çözünürlüklü gürültü bastırma sını ve odak bastırma dışı karşılaştırmasını değiştirin.
Süper çözümlü görüntülerin kalitesini değerlendirmek için ImageJ tabanlı bir eklenti olan NanoJ-SQUIRREL'i kullanarak yapıları tarafsız bir şekilde algılamak için yeniden oluşturulmuş görüntüyü analiz edin. Ortak yerelleştirme analizimizde iki yaklaşım kullandık. İlki, tek bir birlikte yerelleştirme olaylarını gösteren ve her kanalın katkısını tanımlayan profil analizine dayalı görsel bir yaklaşımdır.
Sinaptik belirteçler ve ilgi proteini arasındaki birlikte lokalizasyonu incelemek için ilk adım olarak, süper çözümlenmiş bir görüntü alın ve sinyal çakışmasını belirlemek için tek bir lokus analiz edin. Süper çözümlenmiş görüntüde tek bir locus tanımlayın. Floresan sinyallerin yoğunluk profillerini ilgi çekisine alın.
Profil analizi tek lokus eş lokalizasyonu önermişse, Pearson ve Mander'in katsayıları hesaplanarak tüm görüntünün daha genel bir analizi yapılabilir. Co-localizasyon, Pearson ve Mander's iki parametre belirlemek için JACoP, bir ImageJ eklentisi kullanın. Sistemi kalibre ettikten ve yeniden yapılandırılan görüntülerin kalitesini değerlendirdikten sonra MAP2, nöronal belirteç, psd-95, postsinaptik belirteç ve hedef protein SUMO1'e karşı antikor ile boyanmış primer nöronal kültürleri analiz etmeye başladık.
İlk olarak 40X hedefiyle dört kanallı konfokal mikroskopi yapılan numuneyi analiz ettik. Nöronal süreçleri temsil eden bir alan seçtikten sonra, 100X hedefine geçtik. NanoJ-SINCAP ile yeniden yapılanma kalitesini değerlendirmek ve ortak yerelleştirme analizi yapmak için aynı alanın hem konfokal hem de SIM görüntülerini elde ettik.
Sinapsın yapısını ve bileşiminin aydınlatılması, hafıza yı ve bilişi düzenleyen hem fizyolojik hem de patolojik süreçlerin anlaşılması açısından çok önemlidir. Normal durumda sinapslar bellek yapı taşları iken, onlar da karmaşık nörolojik bozuklukların temelinde, demans Alzheimer hastalığının en yaygın formlarından biri gibi. Burada açıklanan protokol, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu adı verilen süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ile sinapsların protein bileşiminin incelenmesine olanak sağlamaktadır.
