Name: analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light at JoVE.com

Biz yazının yararlı düzeltmeler, tartışmalar ve yorumlar için T. Stürner minnettarız; sinek stokları sağlamak için SL Zipursky; görüntü işleme gerçekleştirmek için M Schölling. Görüntü analizi Bölüm A. Kakita laboratuarda gerçekleştirilmiştir. Bu eser, Yenilikçi Alanları Başlat-up için Alexander von Humboldt Vakfı ve JSPS Bursu Yurtdışı Araştırma (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-İçi Aid (24800024), (25110713), Mochida tarafından desteklenmiştir Takeda, Inamori Daiichi-Sankyo, Toray Temelleri (TS), DZNE çekirdek finansman (GT) ve DZNE Işık Mikroskopi Tesisi (CM).

Bu protokol açıklanan deneysel prosedürler sadece Drosophila ile çalışmak barındırır Almanya ve Japonya&#39;da hayvan refahı kanunlarına tabi değildir. 1. Işık pozlama Koşulları <ol><li> Fotoreseptör R8 nöronların (R8s) &#39;de BRP-GFP görselleştirmek için sensless-Flippase (sens-flp) ve bruchpilot-FRT-DUR-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 taşıyan sinekler hazırlayın. Bakteriyel Suni Kromozom (BAC) içindeki genomik lokus kodlayan BRP Bu BRP-FSF-GFP cDNA yapısı oluşturmak için modifiye edilmiştir. Bu modifiye edilmiş BAC BRP-GFP ekspresyonunu taşıyan sinekler endojen düzenleyici dizilerin kontrolü altında olmakla birlikte, FRT DURDURMA-FRT kasetinin 15 sensless-flippase aracılı çıkarıldıktan sonra R8 fotoreseptör sınırlayıcı. Sens-flp nadiren R7s içinde Flippase ifade eden unutmayın. </li><li> 12 saatlik li sinekler tutmakeclosion (Şekil 1A) kadar larva 25 ° C &#39;de GHT / 12 saat karanlık çevrimi (LD). </li><li> eclosion 6 saat sonra ve sinek gıda içeren yeni bir şişenin içine koyun - Sinekler 0 toplayın. </li><li> Üç aşamada (41 cm yükseklikte, 21 sm bir bazın 4 cm&#39;lik bir kalınlığa ve her adım için 13 sm bir yükseklik) (Şekil 1B) akrilik reçineden yapılmış şeffaf bir rafın içine şişeleri ayarlayın. </li><li> Bir dijital ışık ölçer (Şekil 1C) kullanarak 1000 lux ortalama yoğunluğu ile aydınlatma sağlamak için raf ve bir LED panelde arasındaki mesafeyi ayarlayın. </li><li> 1 sinekler tutun - aşağıdaki koşullardan birinin altında 3 gün: Küçük bir inkübatör 25 ° C&#39;de sabit karanlık (DD), 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsü (LD), ya da sabit ışık (LL) (Şekil 1A ve 1C). </li></ol> 2. Diseksiyon, İmmunohistokimya ve Görüntüleme <ol><li> , Forseps ile sinek beyinleri teşrih% 4 fo ile bunları düzeltmekChaoptin karşı birincil antikor (1:50) ve daha önceki deney prosedürü 25 göre fotoreseptörlerin görüntülenmesi için ikinci bir antikor ile rmaldehyde ve immunostain. kısaca: <ol><li> PBS içinde% 0.1 Triton X-100 (% 0.1 PBT) hazırlayın. Bu çözelti, bir antikor Doku penetrasyonunu arttırmak için kullanılır. </li><li> Bir CO 2 pad üzerinde sinekler uyutmak doğru genotipi sıralamak ve% 0.1 PBT ile dolu bir petri aktarabilirsiniz. </li><li> burnumun altında forseps sopa ve diğer forseps ile sırasıyla sağ ve sol gözleri çekin. </li><li> proboscis ve beyin bağlı trakea çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında,% 0.1 PBT 150 uL ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içine forseps ile beyin aktarın. </li><li> 2.1.3 10 dk tekrar içinde - 2.1.5 mümkün olduğunca çok sayıda beyin elde etmek. </li><li> tüp içine% 16 formaldehit 50 uL ekleyin ve pipetleme karıştırın. </li><li> odasında fiksatif beyinleri inkübe50 dakika boyunca sıcaklığı. </li><li> tüp içinde beyinleri bırakmak dikkat, bir mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL ile üç kez yıkayın. </li><li> şöyle Son yıkamadan sonra, hazırlanan,% 0.1 PBT çıkarın ve primer antikor çözeltisi ekleyin:% 0.3 PBT (% 0.3 PBS içinde Triton X-100), anti-Chaoptin antikorun 4 uL (nihai seyreltme oranı: 1 196 uL ekle : fotoreseptörlerin görünüm için 50). </li><li> 4 ° de CO / N birincil antibodi çözeltisinin içine beyinleri inkübe edin. </li><li> mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL yıkama 3x. </li><li> Son yıkamadan sonra,% 0.1 PBT çıkarın ve bir sekonder antikor içeren% 0.3 PBT 200 uL ekleyin. </li><li> 4 ° de CO / N karanlıkta o inkübe edin. </li><li> mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL ile üç kere yıkanır. </li></ol></li><li> Montaj için, yaklaşık 2 cm Dista bir mikroskop lamı merkezinde bir mikropipet ile bir montaj ortamı (2 ul her biri) iki küçük damla koymakbirbirinden ım. </li><li> Her damla üzerine iki lamelleri, bir koyun ve yaklaşık 0.2 mm lamelleri arasındaki dar bir boşluk bırakın. </li><li> lamel üzerine bir montaj ortamı 15 ul koyun ve montaj aracı madde içine bir mikropipet ile beyin ekleyin. </li><li> Bir mikroskop altında, iki lamelleri arasındaki dar aralıkta (Şekil 2) içine ventral yüzü beyinleri yerleştirin. </li><li> Üstüne bir lamel yerleştirin ve örnek (Şekil 2) düzeltmek için net oje kullanarak lameller kenarları mühür. </li><li> konfokal mikroskop ile beyin görüntüleri elde edebilir. Bir 63X yağ daldırma objektif lens (1.4 NA) ve bir 2.6x dijital zoom kullanın. 0.5 um arasında bir basamak boyutu ile ikinci optik ganglion medulla 20&#39;den fazla optik bölümleri oluşturur. </li></ol> Spot, Yüzey Nesneler, Start-noktaları ve Bitiş noktaları 3. Nesil <ol><li> , Distr sayısını ölçmek içinibution ve BRP-GFP puncta ve delokalizasyon seviyesi, görüntü analiz yazılımı konfokal mikroskobu ile elde edilen yığın açın ve 3D görüntü (Şekil 3A) sulandırmak. Bu çalışmada, aşama IMARIS ile gerçekleştirilmiştir unutmayın. </li><li> Her R8 akson terminali için nokta tespiti modülü tarafından BRP-GFP puncta tanımlayın. <ol><li> &quot;Yeni Noktalar Ekle&quot; seçeneğini seçin. </li><li> algoritma ayarlarında &quot;İlgi Segment sadece bölge&quot; seçeneğini seçin. El medulla bir R8 akson terminali seçin. </li><li> BRP-GFP sinyal kaynağı kanalını seçin. Not: R7 ve R8, fotoreseptör aksonlar, anti-Chaoptin (Şekil 3A) ile immunolabeled edildi. Sadece, R8, birlikte, BRP GFP puncta içerir ve bu nedenle kolayca (Şekil 3A) ayırt edilebilir. Bundan başka, R8 uç M3 medulla tabakası içine giriş noktasında, anti-Chaoptin pozitif akson incelmesi tarafından tespit edilebilir. </li><li> Tahmini XY çap t Seto 0.35 mikron ve spot algılama &quot;Arka Plan çıkarma&quot; kapalı kontrol. </li><li> Filtre tipi &quot;Kalite&quot; yi seçin ve otomatik filtre. Sonra bitirmek tıklayın. </li><li> Diğer R aksonlar (Şekil 3B) için 3.2.1 t 3.2.5 itibaren tekrarlayın. </li></ol></li><li> R8 aksonlardaki BRP-GFP delokalizasyon düzeyini ölçmek her akson (Şekil 3C) için &quot;Surface&quot; fonksiyonu ile yüzey nesneleri oluşturmak için. <ol><li> &quot;Yeni Yüzeyler Ekle&quot; seçeneğini seçin. </li><li> algoritma ayarlarında &quot;İlgi Segment sadece bölge&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra elle medulla bir R8 akson terminalleri seçin. </li><li> Fotoreseptörlerin kaynak kanalını seçin. </li><li> &quot;Smooth&quot; işaretleyin. </li><li> eşik &quot;Mutlak Yoğunluk&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Enable&quot;. &quot;Tohum Noktaları Çapı&quot; 0,5 mm. </li><li> Seçin filter Tip &quot;Kalite&quot; ve &quot;voksellerdeki sayısı&quot; ve daha sonra otomasy filtreyapılsın. </li><li> &quot;Düzenle&quot; ye gidin ve diğer non-ilginç aksonlar oluşturulan yüzeylerin parçaları silin. </li><li> Diğer R akson (Şekil 3C) için 3.3.8 - 3.3.1 itibaren tekrarlayın. Not Bazı yüzey nesneleri çünkü inceliği ve M2 katmanında fotoreseptör zayıf sinyal kesildi, ama yine de baştan uç noktalarına tek bir nesne olarak kabul edildi. </li></ol></li><li> Medulla neuropil her nöron boyunca BRP-GFP puncta dağılımının tespit edilmesi, ölçüm noktası işlevi (Şekil 3D) ile başlangıç noktası ve bitiş noktası tanımlar. <ol><li> &quot;Yeni Ölçüm Noktaları Ekle&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra &quot;Düzenle&quot; seçin ve yüzey nesnelerin en kesiştiği için &quot;Nesne Surface&quot; i seçin. </li><li> sırayla M1 tabakasında R akson yüzey nesnelerin en üstünde ölçüm noktaları koyun. Bunlar şimdi başlangıç noktaları (Şekil 3D) olarak tanımlanır. </li><li> &quot;Yeni Ölçüm Noktaları Ekle&quot; seçeneğini seçin.Daha sonra &quot;Düzenle&quot; seçin ve yüzey nesneleri alt kesiştiği için &quot;Nesne Surface&quot; i seçin. </li><li> sırayla M3 tabakasında R akson yüzey nesnelerin altındaki ölçüm noktaları koyun. Bunlar, artık uç noktaları (Şekil 3B) gibi tanımlanmıştır. </li></ol></li><li> GFP kanalından arka plan sinyalini çıkarmak M6 tabakasının (Şekil 3E) iki R akson yüzey nesneleri, lekeler, başlangıç noktaları ve bitiş noktaları oluşturmak için. <ol><li> &quot;Yeni Yüzeyler Ekle&quot; seçeneğini seçin. </li><li> algoritma ayarlarında &quot;İlgi Segment sadece bölge&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra elle M5 ve M6 tabakası arasında bir R7 akson terminali seçin. </li><li> fotoreseptör kaynak kanalını seçin. </li><li> &quot;Smooth&quot; işaretleyin. </li><li> eşik &quot;Mutlak Yoğunluk&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Seçin filter Tip &quot;Kalite&quot; ve &quot;voksellerdeki sayısı&quot;, daha sonra otomatik olarak filtre. </li><li> &quot;Yeni Noktalar Ekle&quot; seçeneğini seçin;. </li><li> &quot;Elle düzenlemek, otomatik oluşturmayı atla&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Nesne Merkezi&quot; seçin ve 3.5.1 oluşturulan yüzey nesnenin iç alanına bir nokta eklemek - 3.5.6. </li><li> Başka bir R7 akson terminali için 3.5.9 - 3.5.1 itibaren tekrarlayın. </li><li> &quot;Yeni Ölçüm Noktaları Ekle&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra &quot;Düzenle&quot; seçin ve M6 katmanda R7 akson terminali ucu iki yüzey nesnelerin en üstünde ölçüm noktaları koydu. Bunlar şimdi başlangıç ​​noktası olarak tanımlanır. </li><li> &quot;Yeni Ölçüm Noktaları Ekle&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra &quot;Düzenle&quot; seçin ve M6 katmanda R7 akson terminali ucu iki yüzey nesnelerin altındaki ölçüm noktaları koydu. Bunlar, artık uç noktaları (Şekil 3E) gibi tanımlanmıştır. </li></ol></li></ol> Spot sayısı 4. hesaplanması, Nokta Frekans ve Dağılımı Özelleştirilmiş Görüntü Veri Analizi Yazılımı ile BRP-GFP Zenginleştirme Düzeyi <ol><li> dosyasını kopyalayın&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; ve Imaris XT matlab klasörüne &quot;fonksiyonları&quot; klasörü. Bu çalışmada, hesaplama Matlab uygulanan özel bir eklenti ile gerçekleştirilmiştir unutmayın. Web sitesi (gelen eklentisini indirin <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> n noktalar, n yüzeyler ve 2 ölçüm noktası nesneleri, (- 3.4 3.1 hazırlanan) her biri n ölçüm noktaları ile bir veri kümesi açın. İlk ölçüm noktası nesnesi tüm akson için başlangıç ​​pozisyonları tanımlar. İkinci ölçüm noktası nesnesi tüm akson son konumu tanımlar. Her iki ölçüm noktası nesneleri ölçüm noktaları aynı sayıda (yani akson sayısı) olması gerekir. </li><li> Yürütme görüntü işleme &gt;&gt; ÖZEL&gt; sinaps algılama 6 Vs atsushis. </li><li> meta kontrol edin ve doğru olmaması halinde görüntü analiz yazılımı piksel boyutlarını değiştirin. </li><li> perf için kanal seçinnoktalar bölgeler ve sitoplazmik bölgeler (BRP-GFP ile kanal) yoğunluk analizi sergilemiş. </li><li> Sonuçları ihracat için dosya adını tanımlayın. </li><li> yüzde bidonları ve akson uzunluğu sayısını tanımlayın. &quot;10&quot; olarak bidonları ve &quot;% 100&quot; (Şekil 4A ve 4B) olarak depo aralığının numarasını girin. </li><li> BRP-GFP delokalizasyon analizi için noktalar ve diğer sitoplazmik bölgelerin bölgelerin tanımlanması. Enter noktalar &quot;0.35 mikron&quot; ve &quot;50 um&quot; olarak alanı çevreleyen genişliği olarak radius. noktalar yarıçapı (tek punktumdan merkezli 0.35 mikron çapında) puncta GFP sinyali için bölgeyi tanımlar. Alanı çevreleyen genişliği sitoplazmik alanında GFP sinyali bölgesini tanımlayan (punktumdan merkezli 50 mikron çaplı, ancak R8 dahil ve sitoplazmasında tüm nokta alanlar hariç) (Şekil 4A ve 4C). </li><li> tüm nöron maskeleri işlenir kadar bekleyinve PDF dosyaları (Şekil 4B ve 4C) ve bir elektronik tablo içinde daha fazla analiz için bir csv tablo olarak ihraç etti. csv tablo noktaların sayısını, &quot;sitoplazmik alanı&quot; ve tüm R8 akson her bin &quot;spot&quot; maksimum sinyal yoğunluğu ortalama sinyal yoğunluğu içerir. </li><li> arka plandaki sinyal çıkarıldıktan için 3.5 hazırlanmış bir veri kümesi açın. </li><li> 4.9 - 4.3 den açıklandığı gibi görüntü işleme gerçekleştirin. </li><li> Toplam sayısının ortalamasını ve bir tablo (Şekil 4D ve 4E) &#39;de BRP-GFP puncta dağılımını hesaplayın. </li><li> Arka plan sinyali ortalama yoğunluğu ile çıkarılır &quot;spot&quot; maksimum yoğunluğu bölü &quot;sitoplazmik alan&quot; ortalama yoğunluk oranı ile bir elektronik tablo BRP-GFP sinyali yerel olmaktan ortalamasını hesaplayın (Şekil 4F) . </li></ol>

<ol>
	<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Vesicle+Pools+and+Dynamics.">Synaptic Vesicle Pools and Dynamics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).</li><li>Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Synaptic+vesicles+and+pouches+at+the+level+of+&amp;#34;active+zones&amp;#34;+of+the+neuromuscular+junction].">[Synaptic vesicles and pouches at the level of &amp;#34;active zones&amp;#34; of the neuromuscular junction].</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).</li><li>Schoch, S., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+organization+of+the+presynaptic+active+zone.">Molecular organization of the presynaptic active zone.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Presynaptic+Active+Zone.">The Presynaptic Active Zone.</a> Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).</li><li>Owald, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+the+presynaptic+active+zone.">Assembling the presynaptic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).</li><li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+presynaptic+cytomatrix+upon+homeostatic+adaptation+to+network+activity+silencing.">Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing.</a> J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).</li><li>Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+structural+alterations+of+the+active+zone+lead+to+sustained+changes+in+neurotransmitter+release.">Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).</li><li>Spangler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liprin-alpha2+promotes+the+presynaptic+recruitment+and+turnover+of+RIM1/CASK+to+facilitate+synaptic+transmission.">Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission.</a> J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).</li><li>Sugie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Remodeling+of+the+Presynaptic+Active+Zone+of+Drosophila+Photoreceptors+via+Activity-Dependent+Feedback.">Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback.</a> Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).</li><li>Sigrist, S. J., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+plasticity+of+the+cytoplasmic+active+zone.">Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+zone+assembly+and+synaptic+release.">Active zone assembly and synaptic release.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>Hallermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked+dense+bodies+provoke+depression.">Naked dense bodies provoke depression.</a> J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).</li><li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+protein+with+homology+to+ELKS/CAST,+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+labeling+of+synapses+in+vivo+through+synaptic+tagging+with+recombination.">Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination.</a> Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology.">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li><li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+neuronal+morphology,+synapse+number+and+synaptic+recruitment.">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li><li>Danielson, E., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynPAnal:+software+for+rapid+quantification+of+the+density+and+intensity+of+protein+puncta+from+fluorescence+microscopy+images+of+neurons.">SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons.</a> PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).</li><li>Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-guided+automatic+three+dimensional+synapse+quantification+for+drosophila+neurons.">Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons.</a> BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+reconstruction+of+3D+neuron+structures+using+a+graph-augmented+deformable+model.">Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model.</a> Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).</li><li>Sturt, B. L., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+synaptic+fluorescence+in+C.+elegans.">Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans.</a> J Vis Exp. (66), (2012).</li><li>Kremer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+long-term+changes+at+mushroom+body+input+synapses.">Structural long-term changes at mushroom body input synapses.</a> Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).</li><li>Mosca, T. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organization+of+the+Drosophila+antennal+lobe+and+its+regulation+by+the+Teneurins.">Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins.</a> Elife. 3, e03726 (2014).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li><li>Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optic+Lobe+of+Drosophila-Melanogaster+.1+A+Golgi+Analysis+of+Wild-Type+Structure.">The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure.</a> Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).</li><li>Berger-Muller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+role+of+cell-surface+molecules+in+central+synaptogenesis+in+the+Drosophila+visual+system.">Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system.</a> PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).</li><li>Fouquet, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).</li><li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent.">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states.">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışmada, biz eşit bir ışık yoğunluğu sinekler ortaya çıkarmak için ışık koşulları nasıl hazırlanacağını gösterdi. Sizlere sadece bir sinaptik işaretleyici puncta sayısını sayısal hem de mekansal akson boyunca sinaps yoğunluğu gidermek ve sitoplazmik alanlarda işaretleyici protein delokalizasyon düzeyini ölçmek olabilir. Bu üç değerlendirmeler bizi farklı çevre koşullarında tek nöron düzeyinde sinaptik dinamikleri ayrıntılarını değerlendirmek için izin verir. Bizim pr...

<html> sinaptik fonksiyon modülasyonu tam yanıt ya da çevresel uyaranlara değişen uyum sinir sisteminin olağanüstü yeteneği katkıda bulunur. Presinaptik vezikül bırakma olasılığını ayarlanması sinaptik gücü 1 kontrol etmenin bir yoludur. Sinaptik vezikül salım aktif bölge (AZ), presinaptik zar 2&#39;nin özel bir bölgede yer alır. AZ spesifik proteinlerin 3&#39;ün bir kaset, 4 ile karakterize edilir. AZ montaj katkıda Çoğu protein son derece nematod, böcek ve memelilerde 5 korunmuştur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronal aktivite düzeyi da hem in vitro ve in vivo 6, 7 fonksiyonel çıkışının düzenlenmesine katkıda AZ, moleküler yapısı düzenleyen düşündürmektedir&gt; 8. Biz daha önce fotoreseptör AZS doğal ortam ışığı 9 uzun süre maruz kaldıktan sonra Drosophila moleküler biçimlenme geçmesi bulundu. Bu durumda biz Bruchpilot (BRP) -pozitif AZS sayısı fotoreseptör aksonlar indirgendi görülmektedir. BRP / CAST / ELKS ailesi proteinleri omurgalı ve omurgasız sinapsların 10 AZS temel yapı taşlarıdır. Drosophila BRP mutantlar, vezikül açıklaması, 12 11 bastırılır uyarılmış. BRP 17 C-terminali amino asit kalıntıları Drosophila nöromüsküler bileşke (NMJ) 13, 14 sinaptik vezikül Kümelenme için gereklidir. Bu çalışmalar AZ organizasyon ve fonksiyonunda bu molekülün merkezi rolünü göstermiştir. Rekombinasyon (Star), BRP ile son zamanlarda geliştirilen genetik aracı Synaptic Etiketleme ileendojen ekspresyon düzeyleri ve tek bir sinaps çözünürlüğü 15 de, belirli bir hücre tiplerinde in vivo gözlenebilir. Bu araç, bu mümkün nicel olarak karmaşık, merkezi sinir sisteminde sinaps endojen dinamiklerini analiz kolaylaştırır. konfokal mikroskopi elde edilen verilere dayalı sinaps sayımsal dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Sinaptik değişiklikler uzunluk, alan, hacim, yoğunluk ölçümü ve gelişmiş yazılım uygulamalarına dayalı sayısını sayarak değerlendirilmiştir. Örneğin, ücretsiz ImageJ toplam sinaptik alan ve Drosophila NMJ 16 sinaptik yoğunluk ölçümleri için bir miktar yöntemi sağlar. Önceden ve postsinaptik belirteçlerinin ko sitelerin sayısı ImageJ yazılım platformu 17 mevcut eklenti &quot;puncta Analyzer&quot; kullanılarak sayısal edilmiştir. Seçenek olarak ise, bir multi-paradigm sayısal işlem ortamı tabanlı program, Synapse Dedektörü (SYND), otomatik olarak bir floresan işaretleyici ile etiketli nöronların dendritler iz ve ardından hücre gövdesine 18 mesafenin bir fonksiyonu olarak sinaptik protein düzeyleri rakamlarla olabilir. Yazılım Sinaptik puncta Analizi (SynPAnal) konfokal veya floresan mikroskobu elde nöronların 2D görüntüler hızlı analizi için özel olarak tasarlanmıştır. Bu yazılımın ana işlevi protein puncta 19 yoğunluğu ve şiddeti otomatik ve hızlı miktar olduğunu. Son zamanlarda, otomatik öğrenme bazlı sinaps algılama algoritması 3D Görselleştirme Destekli Analizi (Vaa3D) Yazılımın 21 yararlanarak, 3D 20 sinaptik sayısının ölçümü için oluşturuldu. Ticari görüntü analiz yazılımı da sinaptik sayımsal için güçlü araçlardır. Örneğin, flüoresanetiketli nörotransmiter reseptörleri veya presinaptik AZ bileşeni C. tek sinaps çözünürlüğü 22 elegans veya sinapsların yüzlerce izin Drosophila koku sistemi 23, 24, hızla tek bir numune içinde karakterize edilmesi ile üç boyutlu olarak sayısal edilmiştir. Burada, özel bir görüntü analiz yazılımı tarafından bir yöntem mevcut plug-in sayıları, dağıtım ve moleküler bileşenleri zenginleştirme düzeyine dahil AZS yarı otomatik olarak birden fazla yönlerini analiz sağlayan bir çoklu-paradigma sayısal bilgi işlem ortamında uygulanan AZ. Bu nedenle, bu karmaşık analiz, farklı çevresel koşullar altında akson terminallerinde bileşenlerin dinamiklerini değerlendirmek için bize izin verdi. Biz yetişkin sinek Fotoreseptörlerin çıkış sinaps üzerinde ışığa maruz kalma etkisi araştırıldı. Prosedür üç adımda gerçekleştirilir: 1)ışığa maruz kalma, 2) diseksiyon, immünhistokimya ve konfokal görüntüleme, ve 3) görüntü analizi için hazırlık.

<table><tbody><tr><td>Vial</td><td>Hightech, Japan</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>Plug</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>Customized transparent rack made of acrylic resin&amp;nbsp;</td><td>Shin-Shin Corporation, Japan</td><td></td><td>a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step</td></tr><tr><td>Cool incubator</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japan</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>LED panel</td><td>MISUMI, Japan</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>Digital light meter</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Tokken, Japan</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 x 10 mm)</td><td>Greiner Bio-One International, Germany</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablet</td><td>Takara, Japan</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, Japan</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tube</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 16%</td><td>NEM, Japan</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>anti-chaoptin antibody</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide (76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. &amp;amp; Co. KG, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)</td><td>Zeiss, Germany</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial Microscopes</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope Lighting</td><td>Olympus, Japan</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscopy</td><td>Zeiss, Germany</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, Switzerland</td><td></td><td>Version 7.6.4 or above</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel for Mac&amp;nbsp;</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light

sinir sistemi adapte ve çeşitli uyaranlara yanıt olağanüstü bir yeteneği vardır. Bu sinir ayar ölçüde sinaptik düzeyde plastisite ile elde edilir. Aktif bölge (AZ) nörotransmitter salımını aracılık ve iskele proteinlerinin yoğun bir toplama oluşan presinaptik membran bölgedir. Drosophila melanogaster AZS (Drosophila) fotoreseptör doğal ortam ışığına uzun süreli maruz kalma sonrasında moleküler biçimlenme geçmesi. Böylece nöronal aktivitenin düzeyi AZ moleküler kompozisyonu yeniden ve işlevsel çıktı düzenlenmesine katkıda bulunabilir. Immünohistokimyaya ışığa maruz kalma set-up hazırlanmasından başlayarak, bu protokol numarası, mekansal dağılımı ve Drosophila fotoreseptörlerde AZS sinaptik moleküllerin delokalizasyon seviyesini ölçmek için nasıl ayrıntıları. görüntü analizi sof kullanmayazılımlarını, GFP-kaynaşık AZ bileşeni Bruchpilot kümeleri her R8 fotoreseptör (R8) akson terminal belirlenmiştir. Algılandı Bruchpilot noktalar otomatik olarak bireysel R8 akson ayrıldı. akson boyunca nokta frekans dağılımını hesaplamak için, biz bir özel yazılım eklentisi uyguladı. Her aksonun başlangıç ​​noktası ve bitiş noktası elle tanımlanmış ve her Bruchpilot nokta pozisyonu başlangıç ​​ve bitiş noktası arasındaki bağlantı hattı yansıtılıyor edildi. Bruchpilot küme sayısına yanı sıra, kümeler içinde Bruchpilot-GFP delokalizasyon düzeyini sayılabilir. Bu ölçümler farklı çevresel koşullar altında tek bir nöron mekansal çözüme sinaptik dinamikleri uyaranlara ayrıntılı olarak yansıtmaktadır.

Drosophila bileşik göz ~ 780 ommatidia içermektedir, fotoreseptör içeren her sekiz türleri (R1-8). R7 ve R8 proje, katmanlar M6 ve M3, sırasıyla 26 yılında sinaps oluşturan ikinci optik ganglion, medulla, onların aksonları. Fotoreseptör R8 aktif bölgeleri moleküler kompozisyonu üzerine ışığa uzun süre maruz kalma etkisini araştırmak için, biz Star Yöntem 15 yararlandı. BRP endojen ifade seviyeleri floresa...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light at JoVE.com

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

6.5K Görüntüleme.  Niigata University.  Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu. 

Video: Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Biyoloji

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Nörobilim

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Biyokimya

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Investigating Prolonged Depolarizing Afterpotential (PDA) in Drosophila Photoreceptors

Source: Gutorov, R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63514">Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an experimental protocol to investigate the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) in white-eyed Drosophila. The fly&#39;s eye is exposed to intense blue light pulses to convert the photopigment rhodopsin to metarhodopsin, initiating a signaling cascade that opens positive ion channels and causes membrane depolarization. Because blue light prevents the reconversion of metarhodopsin to rhodopsin, the continuous influx of positive ions results in sustained depolarization, known as the prolonged depolarizing afterpotential (PDA).

Drosophila Fotoreseptörlerinde Uzun Süreli Depolarizan Afterpotential (PDA) Araştırılması

1. Measuring the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) using the electroretinogram

	Suitable rearing conditions for Drosophila melanogaster ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Stimulation and Modulation Techniques

Synaptic Modulation in Drosophila After Exposure to Prolonged Light

Source: Sugie, A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55176">Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light.</a> J. Vis. Exp. (120)
This video demonstrates the rearing of Drosophila melanogaster under specific light conditions to study the role of Bruchpilot proteins in neurotransmitter release and the resulting modulation of synaptic activity.

Uzun Süreli Işığa Maruz Kaldıktan Sonra Drosophila'da Sinaptik Modülasyon

1. Light Exposure Conditions

	From the larva stage until eclosion, keep the flies in a 12 h light/12 h dark cycle (LD) at 25 &#176;C (Figure 1A).
	...

Analyzing Synaptic Vesicle Recycling and Fluorescent Dye Uptake in Drosophila Larvae

Source: Kopke, D. L., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57765">FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a protocol to study synaptic vesicle recycling at neuromuscular junctions in channelrhodopsin-expressing Drosophila larvae using a fluorescent dye. Blue light activates the channelrhodopsins, causing calcium influx and synaptic vesicle exocytosis. The dye integrates into the neuronal membranes and is internalized during endocytosis, resulting in enhanced fluorescence. Further blue light stimulation induces exocytosis and dye release, which is shown by reduced fluorescence.

Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi

1. Larval Glue Dissection

	Thoroughly mix 10 parts of silicone elastomer base with 1 part of silicone elastomer curing agent from the elastomer kit ...

Synaptic Modülasyon Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

Drosophila Fotoreseptörlerinde Uzun Süreli Depolarizan Afterpotential (PDA) Araştırılması

Uzun Süreli Işığa Maruz Kaldıktan Sonra Drosophila'da Sinaptik Modülasyon

Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi