Protokolümüz, yüksek verimde düzgün işlenmiş KRAS'lerin izolasyona ve ayrılmasına olanak sağlar. Otantik osuruklu ve karboksimetillenmiş KRAS üretimi, tıpkı memeli hücrelerinde olduğu gibi zarlarında KRAS olan deneylericra etmeyi mümkün kılar. Protokolün yüksek verimi onu önceki çalışmalarından ayırır.
Biz genellikle ifade malzemenin litre başına protein 3-5 miligram arındırmak. Bu bize biyofiziksel ve yapısal biyoloji deneyleri çeşitli yürütmek için izin verir. KRAS kanserlerin% 20 ve pankreas kanserlerinde% 90 mutasyona uğrar.
Yani otantik işlenmiş protein üretmek için bir protokole sahip olmak, kanser hücrelerinin zarında olduğu gibi gerçek proteini inceleyebilmeniz için ilaç ekranları geliştirmek için oldukça yararlıdır. Bu protokol aynı zamanda farnesile tedve tam olarak hücrelerde işlenmiş diğer proteinlerin incelenmesi için de çok yararlıdır. Ve bu yüzden, tek yapmanız gereken KRAS'ı ilgi proteiniyle takas etmek ve baculovirüse koymak.
Kritik adımlar katyon değişimi kromatografisi etrafında olanlar. Uygun kolon kullanarak ve protein düşük tuz tampon içinde zaman sınırlayan başarı için gereklidir. Yağışın bir kar küresi türü olmadığınıanlamak, protokole yeni katılanlara rehberlik eder.
Bu, katyon değişim sütunu yükünü birden çok küçük yüke bölme gereksinimi gösterilerek güçlendirilmiştir. Hücreleri lysing sonra, lysate açıklığa kavuşturulması, ve IMAC ile hedef protein arındırıcı, SDS sayfası ve Coomassie boyama kullanarak protein fraksiyonları analiz. Havuz tepe fraksiyonları ve dört santigrat derece tampon D iki litre karşı bir gecede havuz diyaliz.
Ertesi gün, diyaliz den örnek çıkarın ve herhangi bir çökelti kaldırmak için 10 dakika boyunca 4.000 kez g santrifüj. Son diyalizve açıklık örneği genellikle hala puslu dur, ancak daha fazla işleme gerek kalmadan CEX sütununa uygulanabilir. Tampon G üç sütun hacimleri ile yıkayarak 20 mililitre katyon değişim sütunu hazırlayın, sonra tampon F.Next üç sütun hacimleri ile, tampon E 20 mililitre ekleyerek 100 milimolar son sodyum klorür konsantrasyonu için diyaliz numune20 mililitre seyreltmek ve değişim sütununa örnek uygulayın.
Numunenin küçük bir miktarının tek seferde seyreltilmesi çok önemlidir ve seyreltilmiş numuneler, proteinin yağışını sınırlamak için seyreltildikten hemen sonra kolona uygulanmalıdır. Önceki seyreltme yükün sonuna yaklaştıkça, kolona taze seyreltilmiş numune yüklemeye devam edin. Ardından, genellikle üç sütun hacmi gerektiren arabellek F ile sütunu taban çizgisi emici 280'e yıkayın.
Tampon F'den %65 tampon G'ye kadar 400 mililitrelik degradeile kolondaki proteini, elüent'i altı mililitre kesirlerde toplayarak elüent'i toplayın. Degrade tamamlandıktan sonra, %65 tampon G.SDS sayfası ve Coomassie Blue leke analizinin yanı sıra kromatogramın UV izini kontrol eden pozitif kesirleri seçin. Daha sonra proteini birleştirin ve el yazması talimatlara göre His6 TEV proteaz ile sindirin.
Sindirim ve diyalizden sonra, proteini dakikada üç mililitre tampon A ile dengelenir 20 mililitrelik IMAC sütununa yükleyin. Bu kromatografi sırasında yedi mililitre fraksiyonları toplamak ve tampon A üç sütun hacmi toplam veya taban çizgisi absorbans ulaşıncaya kadar sütun yıkayın. Tampon C'nin beş sütun hacim gradyanı ile hedef proteini %0'dan %10'a kadar eve alın ve yedi mililitre fraksiyon toplayın.
Ardından Pozitif kesirleri SDS sayfası ile tanımlayın. SDS sayfası ile analiz edildiğinde, açıklık lısat füzyon proteinhis6-MBP-tev-KRAS4b karşılık gelen yaklaşık 65 kilodalton göç karanlık bir bant içermelidir. Ortak ifade FNTAb 48 kilodaltons göç eder.
Proteoziz derecesini azaltır ve tam olarak işlenmiş protein zenginleştirir, çünkü arıtma içinde CEX adım önemlidir, ancak protokolün en karmaşık parçasıdır. Bu adımdan tipik bir sonuç KRAS4b-FMe ile belirgin bir tepe üç vardır, ancak elüsasyon profilleri değişken olabilir. ESIMS kullanılarak yapılan sağlam kütle analizi proteinlerin kesin moleküler kütlesini ve böylelikle farnesilasyon veya karboksimetilasyonun göreceli oranını doğrular.
Tipik son kuralar bazı saptanabilir KRAS4b-FARN içermekle birlikte, bu oran bu analizden en yüksek yükseklik açısından %15'ten daha azdı. KRAS4b'nin GSYİh'ya bağlı kütlesini belirlemek için yerli kitle analizi kullanılmıştır. Örnek çözücü, doğal kompleksin bozulmadan kalmasını sağlayan daha yumuşak bir iyonizasyon sağlamak için amonyum asetat ile değiştirildi.
KRAS4b-FMe ve lipozomların etkileşimi yüzey plazmon rezonansı ile ölçüldü ve KRAS4b-FMe'nin membranlara bağlanması için farneslasyon ve karboksimetilasyonu doğrulamak için gereklidir. Beklendiği gibi, KRAS4b-FMe işlenmemiş KRAS4b vermedi ise lipozomlar bağlı. Proteinin düşük tuza maruz kalma süresini en aza indirmek, protokolün verimi etkileyen en kritik tek yönüdür.
Protein sadece kısa bir süre tampon E.The protein seyreltme aşağıdaki bu düşük tuz konsantrasyonu olan protein lipozomlar veya nanodiskler gibi membran mimetikler kullanan biyofiziksel deneyler çeşitli için hangi lipidler KRAS ile etkileşime araştırmak için kullanılabilir. Bu verileri kullanarak, KRAS'ın hücrenin plazma zarı yla nasıl etkileştiğini tahmin etmeye başlayabiliriz. Saflaştırılmış KRAS-FMe kullanarak, meslektaşlarımız kras'ın karmaşık x-ışını kristal yapısını bu proteinin farneslü ve metillenmiş formuna özgü bir şaperonla çözmeyi başardılar.
