Наш протокол допускает изоляцию и разделение правильно обработанного KRAS с высокой урожайностью. Производство подлинно фарнезилированных и карбоксиметилированных КРАС позволяет проводить эксперименты, которые имеют KRAS в их мембране так же, как в клетках млекопитающих. Высокая доходность протокола отличает его от предыдущей работы.
Обычно мы очищаем от трех до пяти миллиграммов белка на литр экспрессивного материала. Это позволяет проводить различные биофизические и структурные биологические эксперименты. KRAS мутирует в 20% рака и 90% в раке поджелудочной железы.
Таким образом, наличие протокола для производства подлинно обработанного белка является весьма полезным для разработки лекарственных экранов, так что вы можете изучить фактический белок, как это было бы на мембране раковых клеток. Этот протокол также очень полезен для изучения других белков, которые фарнезилированы и полностью обработаны в клетках. И как таковой, все, что вам нужно сделать, это поменять KRAS с белка интереса и положить его в baculovirus.
Критические шаги те вокруг хроматографии обмена катиоции. Использование надлежащего столбца и ограничение времени белка в буфере с низким содержанием соли имеют важное значение для успеха. Понимание того, что осадки не являются снежным шаром типа события помогает направлять тех, кто новый к протоколу.
Это усиливается, показывая необходимость разделить нагрузку столбца обмена на несколько меньших нагрузок. После облизывания клеток, уточнения лизата и очистки целевого белка IMAC, проанализируйте белковые фракции с помощью страницы SDS и окрашивания Кумасси. Бассейн пиковых фракций и dialyze бассейн ночь против двух литров буфера D на четыре градуса по Цельсию.
На следующий день, удалить образец из диализа и центрифуги его в 4000 раз г в течение 10 минут, чтобы удалить любой осадок. Окончательный обеззаражненный и уточненный образец часто все еще туманен, но может быть применен к столбецу CEX без дальнейшей обработки. Подготовь 20-миллилитровую колонку обмена катионами, стирая ее тремя объемами столбца буфера G, затем с тремя объемами столбца буфера F.Next, разбавляют 20 миллилитров обезличеного образца до конечной концентрации хлорида натрия в 100 миллимоляжей, добавляя 20 миллилитров буфера Е и применяя образец к колонке обмена.
Очень важно разбавить небольшое количество образца, а не все сразу и разбавленные образцы должны быть применены к колонке сразу после разбавления, чтобы ограничить осадки белка. Продолжайте загружать столбец свежеотбавленным образцом по мере того, как предыдущее разбавление приближается к концу нагрузки. Затем вымойте столбец для базового поглощения 280 с буфером F, который обычно требует трех объемов столбца.
Утелите белок из колонки с градиентом 400 миллилитров от буфера F до 65%buffer G, собирая элуент в шести миллилитровых фракциях. После того, как градиент завершен, продолжайте мыть столбец для дополнительных 1,5 объемов столбца 65%buffer G.Выберите положительные фракции на основе как страницы SDS, так и анализа пятен Coomassie Blue, а также проверки УФ-следа хроматограммы. Затем объединить белок и переварить его с His6 TEV protease в соответствии с рукописными указаниями.
После пищеварения и диализа загрузите белок на 20-миллилитровую колонку IMAC, уравновешенную буфером А на три миллилитров в минуту. Соберите семь миллилитров фракций во время этой хроматографии и промыть столбец в общей сложности три объема столбца буфера или до тех пор, пока базовое поглощение не будет достигнуто. Уберите целевой белок с пятиберным градиентом объема буфера С от 0%до 10% и соберите семь миллилитров фракций.
Затем определите положительные фракции на странице SDS. При анализе со страницы SDS, уточненный лизат должен содержать темную полосу, которая мигрирует примерно до 65 килодалтонов, что соответствует термоядерному белку His6-MBP-tev-KRAS4b. Совместно выраженный FNTAb мигрирует до 48 килодальтонов.
Шаг CEX в рамках очистки имеет решающее значение, поскольку он уменьшает степень протеолиза и обогащает полностью обработанный белок, но является наиболее сложной частью протокола. Типичный результат этого шага имеет видный пик три с KRAS4b-FMe, но elution профили могут быть переменными. Нетронутый массовый анализ с использованием ESIMS подтверждает точную молекулярную массу белков и, таким образом, относительную долю фарнезилирования или карбоксиметилирования.
В то время как типичные финальные партии содержали некоторые обнаруживаемые KRAS4b-FARN, эта доля была менее 15% с точки зрения пиковой высоты от этого анализа. Для определения массы KRAS4b, привязанной к ВВП, использовался местный массовый анализ. Растворитель образца был обменен на ацетат аммония, чтобы обеспечить более мягкую ионизацию, позволяющую родному комплексу оставаться нетронутым.
Взаимодействие KRAS4b-FMe и липосомы было измерено с поверхностным плазмонным резонансом для проверки фарнезилирования и карбоксиметилирования, необходимых для того, чтобы KRAS4b-FMe был связан с мембранами. Как и ожидалось, KRAS4b-FMe связаны с липосомы в то время как необработанные KRAS4b не сделал. Минимизация времени, когда белок подвергается воздействию низкой соли, является самым важным аспектом протокола, который влияет на урожайность.
Белок только кратко на этой низкой концентрации соли после разбавления в буфере E.The белок может быть использован для различных биофизических экспериментов, которые используют мембранные миметики, как липосомы или нанодиски, чтобы исследовать, какие липиды KRAS взаимодействует с. Используя эти данные, мы можем начать экстраполировать, как KRAS взаимодействует с плазменной мембраной клетки. Используя очищенную KRAS-FMe, наши коллеги смогли решить рентгеновская кристаллическая структура KRAS в комплексе с сопровождаемым, который специфичен для фарнезилированной и метилированной формы этого белка.
