Yazarlar Paola López Pieraldi teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. A.H.M. hibe 8G12MD007600 ve bu yayın desteklenen U54-NS083924 için minnettar olduğunu. NIH-NIMHD-G12-MD007583 hibe tesis destek için teşekkür ediyoruz. D.E.R.A. NIHNIGMS-R25GM110513 tarafından sağlanan burs için minnettardır. Ortak araçları alan kullanım için minnettarız ve Dr Priscila Sanabria optik görüntüleme tesis tarafından RCMI programının kullanımı için yardım vermek G12MD007583. Buna ek olarak, Jose Padilla filme ve görsel iletişim kuralı düzenleme olağanüstü rolü için teşekkür etmek istiyorum.

doğum sonrası fareler (Sprague Dawley) 1-4 gün eski cortices izole etmek için kullanılır. Ötenazi işten çıkarma, NIH kurallar tarafından onaylanmış yöntemidir.
 1. cerrahi için malzeme ve aletler hazırlık <ol><li>bir otoklav içinde Sterilize cihazları (sıcaklık: 121 ºC, basınç: 15 psi, Saat: 30 dakika) metal bir kutu ya da bir anlık sterilizasyon çanta mühürleme kullanarak. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.</li>
</ol> 2. DMEM hazırlık tamamlamak <ol><li>Dulbecco autoclaved 700 mL su içeren bir 1 litre kabı içinde eklemek &#39; s modifiye kartal &#39; s orta toz oda sıcaklığında.</li>
	<li>Çözüm bir manyetik karıştırıcı ile karıştırılır 3.7 g/L sodyum bikarbonat, eklemek.</li>
	<li>Ayar pH 7.4, autoclaved su ile Cilt 1 L getirin, sonra filtre. İstediğiniz birimin %10 FBS ve % 1 ile medya kültür amaçlı ek penisilin/streptomisin ve 37 ˚C, sıcak. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek. 
	Not: PH pH metre elektrot medya içine ekleme üzerinden 7,4 için ayarlandı. Medya gerekir karıştırma, sonra yavaş yavaş ekleyin bir damlalık kullanarak 1 M NaOH.</li>
</ol> 3. Birincil Astrocyte kültür Not: tohum sonra hücre medya üç günde değiştirilmelidir ve hücreleri confluency (11-13 gün) en fazla yetiştirilen olabilir. Üçüncü gün, birkaç kez için Asansör mikroglial hücreleri ve oligodendrocyte progenitör hücre kültürü kapalı şişe dokunun, Tümünü Kaldır &#39; eski &#39; medya, iki kez 10 mL PBS kullanarak yıkayın, PBS Aspire edin, sonra taze yeni medya nesnesi. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.
<ol><li>Yeni doğan sıçan beyin diseksiyon <ol><li>gerçekleştir diseksiyon bir doku kültürü Hood. 1-4 gün (2 sıçan beyin 75 cm 2 şişe kullanılır) eski yeni doğmuş fare pups edinin.</li>
		<li>Üç 60 mm petri yemekler hazırlamak ve 5 mL her tam DMEM de pipet. 
		Not: Aşağıdaki gibi ayrılabilir: #1 her fare için beyin, beyin tüm cortices ve #3 (olmadan meninkslerde) soyulmuş cortices için için #2.</li>
		<li>Yavru ve sprey % 70 etanol ile kavramak. O başını kesmek ve vücuttaki küçük biohazard atık konteyner atın.</li>
		<li>Mikro-anatomi cımbız kullanarak, kafa tutun ve cilt kafatasını ortaya çıkarmak için baş üstüne kesmek.</li>
		<li>İle başka bir çifti makas yapmak bir &#34; T &#34; kesi burun doğru kafatasının arkasından başlayarak. Forseps çifti kafatası yavaşça kaldırmak için kullanın.</li>
		<li>Maruz kalan beyin cımbız bir çift ile kaldırın ve beyin bir petri yemekleri daha önce orta ile dolu yerleştirin.</li>
		<li>Steril aletlerin başka bir set için sonraki adımları kullanın.</li>
		<li>Mikro-anatomi forseps 60 mm petri kabına ters kapağını yavaşça bir beyin eklemenizi sağlar. Petri kabına steril gazlı bez yerleştirildiğinde, beyin açıkça görüntülemek mümkündür ve incelemek daha kolaydır.</li>
		<li>Beyin mikro-anatomi Forseps ile sakin ve yavaşça orta çizgi çatlak keskin sonuna mikro-anatomi Forseps ile alay tarafından serebral hemisfer ayrı.</li>
		<li>Deflect ve beyaz madde bırakarak cortices kabuğu ve daha önce #2 etiketli bir petri kabına için aktarabilirsiniz. #2 etiketli petri kabına bütün disseke cortices birleştirerek tüm beyin için yordamı yineleyin.</li>
		<li>Hipokampus her korteks altında çıkar ve bunu atma</li>
		<li>Mikro-anatomi cımbız ve 60 mm petri hafifçe kabuğu zarları bireysel kortikal loblar üzerinden kullanmak ve #3 etiketli petri kabına koyun.</li>
	</ol></li> <li>Doku ayrılma: homogenizer blender yöntemi <ol><li>doku/orta süspansiyon (soyulmuş cortices beyin) steril blender torba içine dökün ve Toplam hacim çantada 5 mL getirmek için yeterli orta ekleyin.</li>
		<li>Çanta çanta yaklaşık 2 cm yukarıda kapalı kapı görünür bırakarak homogenizer blender içine koyun. Hücre ayrışma sırasında yüksek hızda 2.5 min yapılır. 
		Not: Alternatif olarak, bu çantayı kapatma ve yavaşça başlıklı bir ölçek ile vurma tarafından yapılabilir. Bir bez çanta ve kabı arasında sürtünme önlemek için kullandığınızdan emin olun.</li>
		<li>Hücre süspansiyon bir sayı 60 mesh elek dökün ve yerçekimi tarafından filtre uygulamak izin 100 numaralı elek üzerine aracılığıyla akış filtre uygulanmış dökün.</li>
		<li>Kullanarak 15 mL tüpler, santrifüj kapasitesi 200 x g 5 dakika süreyle klinik santrifüj (tercihen salıncak kova rotor) içinde de hücre süspansiyon</li>
		<li>Kapalı bir ölçek süpernatant dökün, sonra serolojik pipet kullanarak yeniden askıya alma ve en fazla 5 mL medya de hücrelerde Pelet ayırmak.</li>
	</ol></li> <li>Hücre sayımı <ol><li>bir micropipette ile hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 100 µL toplayabilir ve trypan mavi 100 µL ekleyebilir.</li>
		<li>Hemasitometre içinde toplanan süspansiyon 10 µL takın ve meydanın dört köşesine uygun tüm hücreleri saymak.</li>
		<li>Şişeler hazırlamadan önce hücreleri yoğunluğunu hesaplamak için formüller şunlardır: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55108/55108eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55108/55108eq2.jpg" /></li> <li>25 cm 2 şişe başına en az 500.000 hücreleri ekleyin. DMEM 5 mL her şişeyi içine kadar pipet. Karışım şişeye boyun ulaşmak gerekir. 3 gün boyunca %5 CO 2, 37 ° C kuluçka koyup, sonra medya değiştirin.</li>
	</ol></li> <li>Astrocyte arıtma teknikleri: medya değiştirmek, mekanik ve kimyasal stratejileri Not: diğer hücre türlerine göre astrocytes metabolizma hızı yüksektir, bu nedenle, beslenme koşullar, bu hücreler bir kaç gün sonra düşük sağkalım oranları göstermek yoksun. Astrocytes, aksine microglia tarafından besin yoksunluğu etkilenmez ve bu tür ortamlar 18 ' çoğalırlar. Mikroglial sayısı azaltılmış korumak için yazarlar her 3 günde astroglial hücre kültür ortamı değiştirin. Bu sürekli bir değişim hücre medyada da astrositik hücre monolayer şişesi 19 üstüne büyüyebilir mikroglial nüfus azalır.
	<ol><li>Kullanımı bir Pasteur pipet medya yapışık olmayan mikroglial hücrelerden her biri şişeler ile Aspire edin. Herhangi bir enkaz yaptı dropwise bir şekilde (5 mL/şişesi) steril filtre PBS her şişeler kullanarak arkasında yıkama.</li>
		<li>Steril filtre DMEM (ile sığır serum antibiyotik ve fetal) dropwise her şişeyi (5 mL/şişesi) ekleyin. Tüm yüzey kapsayacak şekilde dairesel hareketlerle hafifçe kışkırtmak.</li>
		<li>Bir 37 hücrelerde yer ve#176; 8-10 şişe confluency ulaşana kadar gün için % 5 CO 2 C İnkübatör (&#62; % 95 plaka kapsama). 
		Not: Birkaç protokol astrocytes confluency ulaştığınızda, 2 kültür 24 h, sallayarak gibi mekanik yöntemleri, yol üstünde tepe-in bu astrocytes, esas olarak microglia ve öncü hücreleri yalan hücreleri dekolmanı göstermiştir 19 , 20.</li>
		<li>Sigara astrositik hücre kültüründe 30 dk için 180 RPM yörünge sallayarak gerçekleştirerek azaltılır. Hücrelerin içinde süpernatant kaldırdıktan sonra taze medya şişeye (~ 15 mL) pipetted.</li>
		Oligodendrocyte progenitör hücrelerin ortadan kaldırmak için <li>6 h 21 , 22 , 23, aspiratı süpernatant ve damlalıklı taze medya için 200 d/d sallama hızını artırın. 
		Not: Microglia kültürlerde varlığı azaltmak için iki kimyasal yöntem ardışık olarak kullanılabilir (aynı anda) birincil hücre kültür yöntembilim: arabinoz sitozin (Ara-C) ve L-lösin metil ester (LME) 24.</li>
		<li>Hücre confluency (% 100) ulaştığınız zaman hemen 3-4 gün microglia, mekanik çıkarıldıktan sonra bu hücreler antimitotic bileşik arabinoz sitozin (Ara-C) 8 µM ile DMEM içinde 5 gün (değişikliği DMEM taze Ara-C günlük) tedavi edilebilir. 
		Not: Bu bileşik hızla bölen hücreleri microglia 19 , 25 ve fibroblastlar gibi sayısını azaltır antimitotic bir ilaç, Ara-C eklemek için zaman noktası kritik olduğu için 26 . Microglia aksine, konfluent ne zaman, astrocytes durmak via temas inhibisyonu 27 Proliferasyona.</li>
		<li>Ara-C tedaviden kurtarmak hücreler için 2 gün izin.</li>
		<li>Confluency, hücre ulaştıktan sonra daha da mikroglial kirliliği azaltmak için pH 7.4, 37 ˚C 1 h için sabit DMEM L-lösin metil ester (LME) 50 mM kullanın. 
		Not: LME hücre ve organelleri membran aşar ve hidrolize sonra üretilen L lösin bu hücrelerde organellerin içinde birikir. Bu amino asit birikimi bir ozmotik şişlik ve rüptür organellerin 28 , 29 yol açar. LME diğer hücreleri 20 , 30 ' a göre microglia, ortadan kaldırarak son derece etkili.</li>
	</ol></li></ol> 4. Astrocytes 6-şey tabak içinde yetiştirilmesi <ol><li>kaplama coverslips Poli-D-lisin ile <ol><li>sonra her 35 mm petri kabına seyreltilmiş Poly-D-lizin çözüm her coverslip için 100 µL ekleyin ve 1 h. bekleyin yerine bir coverslip</li>
		<li>Poli-D-lizin kaldırmak ve iki kez 2 mL steril su ile yıka.</li>
		<li>Su kaldırmak ve coverslips kapağın içinde kurumasını bekleyin. Coverslips-20 ° c ilâ iki hafta için mağaza. 
		Not: Don seyreltilmiş Poly-D-lizin eriyik; iki haftaya kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li> <li>Trypsinization <ol><li>bir Pasteur pipet kullanarak şişeler ortamından Aspire edin. 5 mL/şişesi yavaşça hücreleri durulama için PBS steril süzülmüş ekleyin.</li>
		<li>Aspiratı PBS kapalı ve 5 mL/şişesi % 0.25 tripsin ve 0,5 mM EDTA çözüm steril süzülmüş ekleyin. 37 ˚C, % 5 CO 2 kuluçka 10 dakika süreyle şişeye koyun 
		Not: Hücreleri kuluçka iken, 5 mL/şişesi taze tam DMEM 37, sıcak ° C.</li>
		<li>Sonra 10 dk, kuluçka, tahrik tüm hücreleri şişesi kaldırdı emin olmak için. 5 mL sıcak tam DMEM de her şişeyi tripsin etkisiz hale getirmek için hızlı bir şekilde eklemek.</li>
		<li>Yavaşça yukarı ve aşağı herhangi kadar kırmak için birkaç kez hücreleri pipette &#34; kümeleri &#34;. Askıya alınan hücreleri iki şişe 15 mL konik santrifüj tüpü transfer.</li>
		Hücre Pelet toplamak için <li>santrifüj 200 x 5 min için g. Pelet orta 500 µL içinde yeniden askıya alma ve şişeler içinde hücreleri yerleştirmek için devam. 
		Not: Hücrelerle yapılacak analizler örnekleri: 1) gen ekspresyonu; analiz etmek için ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) 2) protein ifade değerlendirilemiyor Western blot; 3) Akış Sitometresi Analizi nöral progenitör hücre sayısı ve proteinler ilgi ölçmek için; 4) protein ifade ve yerelleştirme çözümlemek için ayirt.</li>
	</ol></li> <li>Tohumlama astrocytes <ol><li>sonra tripsin ile birincil astrocytes tedavi (4.2 için bakın), hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 100 μL toplamak ve % 0.5 trypan mavi 100 μL ekleyin.</li>
		<li>Ekleyin 10 μL trypan toplanan süspansiyon mavi için hemasitometre ve uygun tüm hücreleri saymak.</li>
		<li>Formüller adım 3.3 şişeler hazırlamadan önce hücreleri yoğunluğunu hesaplamak için kullanın.</li>
		Bir steril ekleyerek <li>hazırla çok iyi yemekler, Poli-D-lizin coverslip her şey için kaplı. 50.000 hücreleri pipette ve taze orta (yaklaşık 2 mL) ile çok iyi her yemeğin hacmindeki geri kalanını doldurun.</li>
		<li>Çok iyi yemekler 37 ˚C kuluçka %5 CO 2 içine koyun ve 5-7 gün sonra astrocytes olabilir büyümek ve coverslips tüm yüzeyine kapak.</li>
	</ol></li></ol> 5. OGD protokolü için birincil Astrocytes <ol><li>OGD orta hazırlık <ol><li>ek Dulbecco &#39; s modifiye kartal &#39; s orta-Alerjik glikoz 3.7 g/L sodyum bikarbonat ve % 1 ile penisilin/streptomisin. Tablo 4 malzemelerinde bkz:.</li>
		<li>Tasfiye glikoz ücretsiz orta 20 mL % 95'i N 2 / %5 köpüren tarafından CO 2 min bir akışı 15 L / (debimetre ile belirtilir) ortamda gaz sistemi için serolojik pipet ekleyerek, 10 dk için. 
		Not: Oksijen orta tasfiye sonra pH 7,4 (adım 2.1 nota bakın) adlı ayarlayın.</li>
		<li>Filtre 50 mL tüp filtre sistemi kullanılarak silinen glikoz-Alerjik orta. 
		Not: Taze OGD orta köpüren ile % 95'i N 2 / %5 her deneme için yapmak, hücreleri oksijen tasfiye bir ortama maruz kalır emin olmak için kullanmadan önce CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Deneysel bir işlem <ol><li>doku kültürü başlık içinde önceden hazırlanmış coverslips (4.3.5 adıma bakın) astrocyte medya kaldırmak ve herhangi bir glikoz hücreleri üzerinde iki kez kaldırmak için hücresel PBS ile yıkama.</li>
		<li>2 mL OGD medya ekleyin Her şey ve çok iyi yemekler ile onların kapakları kapalı hipoksi odası içine yerleştirin</li>
		<li>Gaz karışımı giriş Vana bağlanmak ve çıkış vanası açık bırakın. Gaz karışımı % 95'i N 2 / %5 ile odası sifonu CO 2, 15 L/min 5 dakika süreyle</li>
		<li>Gaz akışını durdurmak ve ilk çıkış vanası üzerinde kelepçe kapatın, sonra gaz giriş Vana boru üzerinde kelepçe kapatın. 
		Not: Sabunlu su ile odası ve mühür kapsayan hiçbir gaz kaçağı olduğundan emin olun. Mühür güvenli ise, hava kabarcığı yok oluşturmalıdır.</li>
		<li>Hücre kültür kuluçka 37 ° c 6 h OGD veya 1 h için tüm odası yerleştirin.</li>
		<li>Kuluçka süresi bittikten sonra OGD medya Aspire edin ve dikkatli bir şekilde normoxic için de her 4,67 cm 2 tam DMEM 2 mL damlalıklı işlemek 24 h</li>
	</ol></li></ol> 6. Birincil Astrocyte ayirt hazırlık için protokol Not: astrocyte saflık değerlendirmek için nöronlar, microglia ve oligodendrocytes tarafından tespit edilebilir gibi farklı beyin hücresi türleri ayirt farklı hücre işaretçileri kullanarak. Nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri, PCNA ve propidium iyodür (PI) birincil astrocytes normoxic koşulları tarafından takip OGD maruz üzerinde kullanılabilir. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.
<ol><li>Ayirt hazırlık Not: bu bir genel ayirt protokol, küçük değişiklikler (örneğin, uzun kuluçka dönemleri, en iyi bir sinyal elde etmek için gerçekleştirilen inkübasyon sıcaklığı). Her işareti Tablo 1-ebilmek var olmak kullanılmış üretici göre &#39; s protokolü.
	<ol>Hücre canlılığı, değerlendirmek için <li>hücreleri ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe PI (tam DMEM içinde 5 mikron) ve yıkama iki kez 2 mL PBS için PI boyama gösteren 5 dk. daha az canlı hücrelerdir. 
		Not: Kullanım hücreleri tedavi adım 5.2.6.</li>
		PI boyama sonra hücreleri düzeltmek için <li>ekleyin 2 mL % 4 formalin 4,67 cm 2 başına, 20 dk 4 ˚C az için. PCNA ile etiketli örnekleri için tercih edilen sabitleme metanol için 10 dk 4 ˚C az çözümdür. 
		Uyarı: Formalin ve metanol zehirli. 
		Not: Her zaman kontrol spesifik antikor her şirket iletişim kurallarından.</li>
		<li>Yıkama PBS 2 mL 5 min için hücrelerle ve 3 kez bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Çözüm engelleme hücreler kuluçkaya (% 0.5 iyonik olmayan yüzey aktif, % 10 PBS FBS) nazik sallayarak ile oda sıcaklığında 30 dk için.</li>
		<li>PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıka, yıkama 3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>% 1'lik bir çözümde birincil antikor (PCNA, GFAP'nin) ile 4 ° C'de, gecede (16 h), kuluçkaya PBS FBS.</li>
		<li>Birincil antikor çözümü kaldırmak, PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıkayın ve 3 kez bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Incubate fluorophore % 1'lik bir çözümde ile Birleşik ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 h için PBS FBS.</li>
		<li>PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıka, 3 kez bu işlemi tekrarlayın. 1 µg/mL DAPI ekleyin (4 &#39;, 6 &#39; - diamidino - 2-phenylindole) hücre çekirdeği leke 5 min için.</li>
		<li>Yıkama PBS 5 dk 2 mL hücrelerle, iki kez bu işlemi tekrarlayın ve PBS içinde devam.</li>
		<li>Coverslips montaj orta kullanma mikroskop Slayt üzerindeki hazırlayın.</li>
	</ol></li> <li>Confocal mikroskop <ol><li>mikroskobu ayarladıktan sonra coverslip yan mikroskop Sahne Alanı'nda yerleştirin.</li>
		<li>Yazılım kullanarak bir lazer ışını 543nm için GFAP'nin-Cy3 konjuge antikor adlı seçin.</li>
	</ol></li></ol> 7. Canlılığı tahlil hücre <ol><li>Trypsinize ve astrocytes numaralı adımları uygulayarak tarafından 4.3 ve 4.4 ölçmek.</li>
	<li>1 x 10 4 hücreleri/iyi 96-şey tabakaları bana ekleyin ve onları confluency için büyümek.</li>
	<li>Adım 5 metodoloji kullanarak, her iki normoxic 1 h OGD kültürlü 96-şey tabak maruz veya 6 h OGD.</li>
	<li>Sonra OGD tedavi, normoxic medya 24 h için tüm hücrelere eklenir ve canlılığı MTT reaktif tahlil kullanılarak ölçülür (üretici firma olarak kullanmak &#39; s yönergeleri gösterir).</li>
	<li>Bir 5 mg/mL MTT çözümden her şey için toplam hacminin % 10 ekleyin ve 3 h 37 ˚C ile MTT reaktif için kuluçkaya.</li>
	<li>Ortamını çıkarın ve 200 µL Dimetil sülfoksit kullanarak kristalleri resuspend. Spektrofotometre, 570 plaka okuma nm. 
	Not: Azalmış bir Absorbans kontrol hücreleri göre daha az canlılığı ile ilişkilendirmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrater+reliability+of+the+NIH+stroke+scale.">Interrater reliability of the NIH stroke scale.</a> Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).</li><li>Hinkle, J. L., Guanci, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ischemic+stroke+review.">Acute ischemic stroke review.</a> J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).</li><li>Kassner, A., Merali, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Stroke.">Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke.</a> Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).</li><li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+stroke:+mechanisms+in+search+of+treatments.">The science of stroke: mechanisms in search of treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li><li>Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elusive+roles+for+reactive+astrocytes+in+neurodegenerative+diseases.">Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).</li><li>Broderick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+Management+of+Spontaneous+Intracerebral+Hemorrhage+in+Adults+2007+Update:+A+Guideline+From+the+American+Heart+Association/American+Stroke+Association+Stroke+Council,+High+Blood+Pressure+Research+Council,+and+the+Quality+of+Care+and+Outcomes+in+Research+Interdisciplinary+Working+Group:+The+American+Academy+of+Neurology+affirms+the+value+of+this+guideline+as+an+educational+tool+for+neurologists.">Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists.</a> Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-glucose+deprivation+induced+glial+scar-like+change+in+astrocytes.">Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes.</a> PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+astrocytes+in+neural+repair+and+protection.">Reactive astrocytes in neural repair and protection.</a> The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+adult+rat+astrocyte+cultures.">Characterization of adult rat astrocyte cultures.</a> PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Hypertrophy+Contributes+to+Aberrant+Neurogenesis+after+Traumatic+Brain+Injury.">Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury.</a> Neural Plast. , 1347987 (2016).</li><li>Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+and+Intermediary+Metabolism+and+Astrocyte-Neuron+Interactions+Following+Neonatal+Hypoxia-Ischemia+in+Rat.">Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat.</a> Neurochem Res. , (2016).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+cell+cycle+progression+reduces+reactive+astrogliosis+initiated+by+scratch+injury+in+vitro+and+by+cerebral+ischemia+in+vivo.">Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo.</a> Glia. 55 (5), 546-558 (2007).</li><li>Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+over+resting+and+reactive+astrocytes.">Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes.</a> Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).</li><li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+scar+formation+aids+central+nervous+system+axon+regeneration.">Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration.</a> Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).</li><li>Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-like+cells+originate+from+neuroepithelium+in+culture:+characterization+and+properties+of+the+macrophage-like+cells.">Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells.</a> Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Giulian, D., Baker, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ameboid+microglia+isolated+from+developing+mammalian+brain.">Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain.</a> J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16 (3), 282-292 (1998).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+microglia+from+primary+cellular+cultures.">Depletion of microglia from primary cellular cultures.</a> Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).</li><li>Svensson, M., Aldskogius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+density+of+axotomized+hypoglossal+motorneurons+following+pharmacological+blockade+of+the+microglial+cell+proliferation.">Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation.</a> Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).</li><li>Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rabbit+ocular+fibroblast+proliferation+by+5-fluorouracil+and+cytosine+arabinoside.">Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside.</a> J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).</li><li>Nakatsuji, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+dependent+modulation+of+cell+cycle+protein+expression+in+astrocytes.">Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes.</a> J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).</li><li>Reeves, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+amino+acids+by+lysosomes+incubated+with+amino+acid+methyl+esters.">Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters.</a> J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).</li><li>Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+of+the+accessory+cell+necessary+for+mitogen-stimulated+T+and+B+cell+responses+in+human+peripheral+blood:+delineation+by+its+sensitivity+to+the+lysosomotropic+agent,+L-leucine+methyl+ester.">Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester.</a> J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).</li><li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes.">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li><li>Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+modulation+of+calcium+channel+activity+in+cultured+rat+astrocytes.">Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).</li><li>Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+dissolved+oxygen+from+water:+A+comparison+of+four+common+techniques.">Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques.</a> Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).</li><li>Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oxygen-glucose+deprivation+to+study+ischemic+cell+death.">In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death.</a> Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+testing+of+hypoxia+in+cell+culture.">Induction and testing of hypoxia in cell culture.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Rivera-Aponte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+reduces+functional+expression+of+astrocytic+Kir4.+1+channels+and+glial+glutamate+uptake.">Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake.</a> Neuroscience. 310, 216-223 (2015).</li><li>Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharides+do+not+alter+metabolic+disturbances+in+hippocampal+slices+of+fetal+guinea+pigs+after+oxygen-glucose+deprivation.">Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation.</a> Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).</li><li>Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+anoxic+depolarization+protects+without+functional+compromise+following+simulated+stroke+in+cortical+brain+slices.">Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices.</a> Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).</li><li>Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxic+depolarization+mediates+acute+damage+independent+of+glutamate+in+neocortical+brain+slices.">Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices.</a> Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı astrocytes sıçan cortices üzerinden yalıtım açıklar. Bu yöntemde, microglia, oligodendrocytes ve fibroblastlar gibi hücresel diğer türleri ile kirlenme azaltmak için önemlidir. Microglia sayısını azaltmak için çeşitli adımlar alınabilir: medya, orbital sallayarak ve kimyasal tedaviler değiştirme. Kültür saflık ayirt seçici hücresel işaretçileri kullanarak veya en önemli hücre kirleticiler için onaylandıktan sonra deneyler yapılabilir. Örneğin, iyonize kalsiyum ba?...

Kontur "bir akut nörolojik disfonksiyon vasküler kökenli ani veya hızlı geliştirme belirti ve bulguları, karşılık gelen beyin Fokal alanlarda katılımı ile"1,2olarak tanımlanır. Kontur iki tür vardır: Hemorajik ve iskemik. Vasküler disfonksiyon ya beyin kanaması veya posterior bir arter rüptürü ile zayıflaması tarafından eşlik arteriyovenöz bir arıza neden olduğu bu, çoğu durumda, ölüme götürecek hemorajik inme3 olarak adlandırılır. Bir trombüsü veya bir pıhtısı kan akışını engelleyen, oksijen ve glikoz bir beyin bölgesine geçici bir yoksunluk neden iskemik inme4denir. Hücrelerin etkilenen bölge veya iskemik çekirdek liderlerine homeostatik ve metabolik dengesizlik, enerjik disfonksiyon, nöronal ölüm ve inflamasyon5yaşam boyu Engelli hastalar6tetikleyebilir, etrafında beslemek için hata oluştu.
İskemik inme hücrelerin bu tepki ve uygulamak etkileri farklı zaman noktalarda çeşitli türleri içeren multifaktöriyel bir yaralanma olduğunu. Çok etkileşimleri tek tek hücreler davranışını çalışmaya zor bir ortam oluşturun. Yani, bir belirli hücre türü'nün altında karmaşık bir ortam katkısını nasıl çalışıyoruz? Bir kabul edilen vitro modeli iskemi hücrelere oksijen ve glikoz yoksunluk (OGD), açığa belirli bir süre için bir normoxic ortamına hücreleri restorasyon tarafından takip oluşur. Bu sistem tarafından kan reperfüzyon takip bir iskemik inme taklit eder. Bu yöntemde, hücre ve dokulara oksijen kullanarak özel bir hipoksik odası, tasfiye bir ortamda glikoz-Ücretsiz medya maruz kalır. OGD kuluçka süresi birkaç dakika 24'e kadar s hipotezini test edilecek istiyor bağlı olarak değişebilir. Çalışmalar bu OGD kez bağlı olarak göstermiştir ve normoxic çevre, inme (Yani, akut veya Subkronik) belirli fenotipleri elde edilebilir. Normoxic koşulları, posterior restorasyon ile OGD için maruz birincil izole astrocytes kontur tüp bebek7taklit etmek için iyi çalışılmış bir hücresel model var. OGD izole hücreler bir inme benzeri ortamı altında bağımsız moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak mümkündür.
Astrocyte Biyoloji ile ilgili bilgilerimizi arttıkça, onlar sinapslarda Bakımı ve sinirsel tamir, geliştirme ve plastisite8sürdürülmesi için çok önemli olduğunu belirgin olmuştur. Normal şartlarda astrocytes yayın ve sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri ve gliotransmitters metabolik denge ve homeostasis sinapslarda5,9içinde tutmak, yanıtlar. İskemik inme gibi akut neuroinflammation içinde bu hücreler reaktif olmak, uzun vadeli overexpression, gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP'nin) gösterebilir ve onların morfolojisi5,10', hipertrofisi göster 11 , 12. iskemik enfarktüsü geliştikçe, astrocytes tarafından sağlanan homeostazı etkilenen olur, normal Glutamat alımı, enerji metabolizması, etkin moleküller ve antioksidan aktivite13değişimi ile ilgili.
Doğru lesioned alan14lökosit göç ederken yeniden etkinleştirilen astrocytes etrafında enfarktüsü doku çoğalırlar. Astrositik yayılması Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA), Ki67 ve bromodeoxyuridine (BrdU)15gibi işaretçileri kullanarak ölçülebilir. Bu proliferatif yanıt Saat-bağımlı bir şekilde oluşturulur ve gliyal yara, bir yaralanma9sonra bozuk sitesini parankimi boyunca geri dönüşümsüz reaktif astrocytes dizisi oluşturan yardımcı olur. Bu yara izi ilk işlevleri bu bölgeden bağışıklık hücre ekstravazasyonu kısıtlamaktır. Ancak, çalışmalar yara izi genişletmek, aksonlar büyüme inhibe moleküller serbest olarak ve yaralı alan16uzanan aksonlar engelleyen fiziksel bir bariyer oluşturmak aksonlar için fiziksel bir engeli olur göstermiştir. Yine de, bir omurilik yaralanması sonra tamamen gliyal yara oluşumu engelleyen aksonlar17rejenerasyon zarar olabilir olduğunu gösteren bilimsel kanıt. Böylece, belirli astrositik tepki ölçülür, okudu yaralanma framework düşünülmelidir bağlamında.
Sunulan metodoloji astrocytes bireyselleştirilmiş fonksiyonu oksijen glikoz yoksunluğu sonra eğitim için uygulanabilir ve araştırmacı cevap istiyor soruları bağlı olarak değiştirilebilir. Örneğin, morfolojik değişiklik ve farklı OGD zamanlarda ifade işaretleri yanı sıra, OGD için maruz astrocytes üzerinden supernatants daha fazla çözünür faktörler veya bu hücreler tarafından serbest şartına bir medya olarak değerlendirmek için kullanılan belirlemek için analiz edilebilir, diğer beyin hücreleri yürürlükte. Bu yaklaşım yöneten ve onların yanıt bir iskemik inme senaryo olarak modüle faktörler aydınlatma yol açabilecek astrocyte reaktivite çalışmaları sağlar.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments for Surgery - Step 1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operating scissor 5.5&amp;rdquo;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-6812</td><td>Tools used to decapitate the rats.</td></tr><tr><td>Curved forceps 7&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5271</td><td>Holds the skin of the rat while the skull is removed.</td></tr><tr><td>Micro-dissecting scissors 4&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5882</td><td>Cuts both the skin and skull of the rat.</td></tr><tr><td>Micro-dissecting forceps 4&amp;rdquo; angled, fine sharp&amp;nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5095</td><td>Holds the skin of the rat while the skull is removed.</td></tr><tr><td>Micro-dissecting forceps 4&amp;rdquo; slightly curved 0.8</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5135</td><td>Tool used to separate cortices.</td></tr><tr><td>Micro-dissecting tweezers</td><td>Roboz Company</td><td>RS-4972</td><td>Peels brain meninges.</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Important for removing the meninge from the cortices.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DMEM Preparation - step 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>GibCo. Company</td><td>11995-065</td><td>Supports the growth of cells.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>Supplement for the cell culture media.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GibCo. Company</td><td>10437-010</td><td>Serum-supplement for the cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GibCo. Company</td><td>15140-148</td><td>Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.</td></tr><tr><td>Filter System 1L with 0.22um pore</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Astrocyte culture - step 3&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipets 5mL</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>To pipette DMEM to containers with cells.</td></tr><tr><td>Serological pipets 10mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>To pipette DMEM to containers with cells.</td></tr><tr><td>Serological pipets 25mL</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>To pipette DMEM to containers with cells.</td></tr><tr><td>Centrifuge conical tube 15mL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200250</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock tube 1.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Barrier Tips 200 uL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201725</td><td></td></tr><tr><td>Barrier Tips 1 mL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201727</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Orange Bag 14 x 19&quot;</td><td>VWR</td><td>14220-048</td><td></td></tr><tr><td>60mm petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze pads</td><td>Honeywell Safety</td><td>89133-086</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster</td><td>Sewar Lab System</td><td>030010019</td><td>Triturate the brain tissue.</td></tr><tr><td>Stomacher 80 Blender Sterile Bags</td><td>Sewar Lab System</td><td>BA6040</td><td>Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.</td></tr><tr><td>Beaker 400mL</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell dissociation sieve, mesh #60&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S1020</td><td>To obtain a uniform single cell suspension.</td></tr><tr><td>Sterile cell dissociation sieve, mesh #100</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S3895</td><td>To obtain a uniform single cell suspension.</td></tr><tr><td>Invert phase microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclypse Ti-S</td><td>Verify cells for contamination or abnormal cell growth.</td></tr><tr><td>75cm2 sterile flasks</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plate</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round</td><td>VWR</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>L1002</td><td>Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.</td></tr><tr><td>Cytosine &amp;beta;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>GibCo. Company</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;OGD Medium Preparation - step 5&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge conical tube 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium-free glucose</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D5030</td><td>Supports the growth of cells.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>Supplement for the cell culture media.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GibCo. Company</td><td>15140-148</td><td>Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.</td></tr><tr><td>200mM&amp;nbsp; L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>GibCo. Company</td><td>25030-081</td><td>Amino acid that supplements the growth of cells.</td></tr><tr><td>Phospahet buffer saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Filter System 50mL with 0.22um pore</td><td>Corning</td><td>430320</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge conical tube 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Single Flow Meter&amp;nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SMF3001</td><td>Measure gas flow in oxygen purge.</td></tr><tr><td>Hypoxia Incubator Chamber&amp;nbsp;</td><td>StemCell</td><td>27310</td><td>Generates a hypoxic environment for the cell culture.</td></tr><tr><td>Traceable Dissolved Oxygen Meter</td><td>VWR</td><td>21800-022</td><td></td></tr><tr><td>95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture</td><td>Linde</td><td></td><td>Purges the environment of oxygen.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;primary astrocyte immunofluorescence - step 6&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Formaline Solution Neutral Buffer 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Solution used to fix cells.</td></tr><tr><td>Methanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>A4544</td><td>Solution used to fix cells.</td></tr><tr><td>Non-ionic surfactant (Triton X-100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GibCo. Company</td><td>10437-010</td><td>Serum-supplement for the cell culture.</td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Cell Signaling</td><td>24307</td><td>Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.</td></tr><tr><td>Anti-PCNA</td><td>Cell Signaling</td><td>2586</td><td>Detects proliferating cells.</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4170</td><td>Apoptosis staining.</td></tr><tr><td>Anti-Olig1</td><td>Abcam</td><td>AB68105</td><td>Detects mature oligodendrocytes.</td></tr><tr><td>Anti-Iba1+</td><td>Wako</td><td>016-20001</td><td>Detects microglial cells.</td></tr><tr><td>Anti-GFAP Conjugated with Cy3&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>C9205</td><td>Detects reactive astrocytes in the treated cells.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A1101</td><td>Anti-Mouse Secondary Antibody.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A21428</td><td>Anti-Rabbit Secondary Antibody.</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6&amp;rsquo;-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D9542</td><td>Nuclear staining.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring astrocyte reactivity and proliferation in vitro under ischemic-like conditions

İskemik inme trombüsü veya kan akımı beyin bölümlerine tıkayan embolinin kaynaklanan bir karmaşık beyin hasarı var. Bu oksijen ve enerji yetmezliği ve nöronal ölüm nedenleri glikoz yoksunluğu için yol açar. İskemik inme hakaret sonra astrocytes reaktif olmak ve bu geliştikçe yaralanma sitenin etrafına çoğalırlar. Bu senaryoda, astrocytes iskemi için maruz beyin bölgesi için belirli katkısını çalışma zordur. Bu nedenle, bu makalede birincil astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı oksijen glikoz yetmezliği (OGD) adı verilen bir iskemi gibi ortamının bir vitro modeli altında çalışmaya bir metodoloji tanıtılmaktadır. Astrocytes 1-4 gün izole-eski yenidoğan fareler ve non-spesifik astrositik hücre sayısı değerlendirildi astrocyte seçici marker gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP'nin) ve nükleer boyama kullanarak. Onlar maruz kalan oksijen yüzdesi yanı sıra astrocytes OGD koşuluna tabi olan dönem özelleştirilebilir. Hücre içinde vitrofarklı grupları iskemik benzeri durumda süresince ayırdetmek bilim adamları bu esneklik sağlar. Bu makalede astrocyte reaktivite, Hipertrofik morfoloji ve Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA) kullanarak ayirt tarafından ölçülen yaygın neden zaman dilimleri OGD, anlatılmaktadır. Hızla çoğalmak, yanı sıra astrocytes enerji ve oksidatif stres geçmesi ve çözünür faktörler cep orta serbest bırakarak OGD için yanıt. Bu orta toplanan ve moleküller hücre hücre etkileşimi olmadan birincil nöronal kültürde astrocytes tarafından yayımlanan etkilerini çözümlemek için kullanılır. Özet olarak, bu birincil hücre kültür model verimli bir şekilde yaralanması üzerine izole astrocytes rolünü anlamak için kullanılabilir.

Birincil astrositik kültürünün ana kaygıları nöronlar, oligodendrocytes, fibroblastlar ve microglia gibi diğer hücrelere varlığıdır. Şekil 1, izole sıçan cortices hücrelerden medya değişikliklerini her 3 günde ve vardı ya tedavi edilmemiş veya tedavi ile LME 1 h. 24 saat sonra eklendi, hücre immunostained GFAP'nin için vardı ve DAPI ile counterstained. Tedavi edilmezse hücreleri ortalama % 39 sigara-GFAP'nin pozitif hücrelerinin, LM...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions at JoVE.com

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

monitoring-astrocyte-reactivity-proliferation-vitro-under-ischemic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

9.8K Görüntüleme.  Universidad Central del Caribe. İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.

Video: Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Nörobilim

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Biyomühendislik

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra<em&gt; In-Vitro</em&gt; İskemi

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Tıp

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through multipotent intermediates. This technique not only holds great promises in the field of disease modeling, as it allows to convert, for example, fibroblasts for patients suffering neurodegenerative diseases into neurons, but also represents a promising alternative for cell-based replacement therapies. In this context, a major scientific breakthrough was the demonstration that differentiated non-neural cells within the central nervous system, such as astrocytes, could be converted into functional neurons in vitro. Since then, in vitro direct reprogramming of astrocytes into neurons has provided substantial insights into the molecular mechanisms underlying forced identity conversion and the hurdles that prevent efficient reprogramming. However, results from in vitro&#160;experiments performed in different labs are difficult to compare due to differences in the methods used to isolate, culture, and reprogram astrocytes. Here, we describe a detailed protocol to reliably isolate and culture astrocytes with high purity from different regions of the central nervous system of mice at postnatal ages via magnetic cell sorting. Furthermore, we provide protocols to reprogram cultured astrocytes into neurons via viral transduction or DNA transfection. This streamlined and standardized protocol can be used to investigate the molecular mechanisms underlying cell identity maintenance, the establishment of a new neuronal identity, as well as the generation of specific neuronal subtypes and their functional properties.

Here we describe a detailed protocol to generate highly enriched cultures of astrocytes derived from different regions of the central nervous system of postnatal mice and their direct conversion into functional neurons by the forced expression of transcription factors.

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...