Bu protokol, transgenik zebra balığı larvalarının tümör ksenogreft vaskülarizasyonunun in vivo kantitatif testini sağlamak için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Bu tekniğin önceki tekniklere göre en büyük avantajı, araştırmacının ksenogreft vaskülarizasyon düzeylerindeki değişiklikleri doğru bir şekilde quantitate etmesini sağlamasıdır. Önemli adım tümör hücrelerinin zebrabalığı larvalarına doğru enjekte edilmesini sağlamaktır, böylece sonraki görüntüleme ve nicelik adımlarından ödün verilmez.
B16-F1 hücrelerini floresan boya ile büyüttükten ve etiketledikten sonra embriyoları implantasyon için hazırlamaya başlayın. 35 milimetrelik bir kabı, E3 çözeltisinde %2'lik metilselülozla yemeğin hacminin dörtte biri kadar doldurun. Transfer pipeti kullanarak, transfer edilen E3 çözeltisinin hacmini en aza indirirken, daha önce hazırlanmış yaklaşık 50 transgenik embriyoyu metilselülozüzerine yerleştirin.
Mikrocapiller pipet ucu kullanarak, embriyoları başları üst, kuyrukları dibe ve sol tarafı yukarı olan embriyolarla dikey olarak yönlendirilen şekilde düzenleyin. Daha önce hazırlanmış bir B16-F1 hücre peletine %50 ECM ekleyerek ecm'ye ikiye bir oranında bir hücre karışımı üretin. Pipetleme ve karıştırarak iyice karıştırın ve karışımı buz üzerinde saklayın.
Hücrelerin üç ila 10 mikrolitre almak için bir mikrocapiller pipet kullanın. Pipet ucunu önceden hazırlanmış bir mikroenjeksiyon iğnesine dikkatlice takın ve b16-F1 matris karışımını iğnenin ucuna fırlatın. İğneyi iğne tutucuya takın ve tabağa 45 derecelik bir açıyla yatırın.
Hücreleri sıkmadan iğneden dışarı atılması için hücrelerin yeterince büyük bir delik açmak için iğneucu kırmak için cımbız kullanın. Enjeksiyon cihazına bağlı basınçlı hava silindirini açın ve hücreleri iğnenin ucuna itmek için enjektörü bir saniyeden fazla süreyle sürekli modda açın. İğneyi bir embriyonun yumurta kesesi doğru nokta ve iğne ucu yumurta kesesi ortaya çıkmıştır ve embriyonik epidermis embriyonik epidermis embriyonik tarafında itiyor kadar bir ventral yönde bir yolk kese ile itin, sadece kalbe posterior.
Epidermis ve yumurta kesesi zarı arasında küçük bir boşluk yaratana kadar iğnenin ucunu dikkatlice ve hafifçe ileri doğru itin. Hücre karışımının bir kısmını bu perivitellin uzayına fırlatmak için enjektöre darbe at. İmplantırken ksenogreftin büyüklüğüne, şekline ve konumuna dikkatlice bakın ve doğru implante edilmiş bir ksenogreft sağlamak için iğnenin darbe numarasını ve konumunu buna göre ayarlayın.
500 ila 800 hücre perivitelline uzaya enjekte edilmiş kadar darbeleri tekrarlayın, sarısı kesesinin alt boyunca yolun en az yarısını uzanan görünür bir şişkinlik oluşturarak. İğneyi embriyodan çıkar. Tüm embriyolar enjekte ettikten sonra, mümkün olduğunca az metilselüloz ile dışarı borulu böylece birlikte tüm embriyolar itmek için bir mikrocapiller pipet ucu kullanın.
Embriyoları PTU ve metilen mavisi e3 içeren bir kurtarma kabına aktarın. Sonra yavaşça onları yıkamak için embriyoların etrafında E3 pipet, ve sonra 34 santigrat derece kuluçka. Sonra konfokal mikroskop kullanarak anestezili embriyoları görüntüleyin.
Tümör hücrelerinin görüntülenecek bir hacmi belirlemek için uygun bir lazer kanalı kullanın, greftin her iki tarafında en az bir veya iki optik bölüm için izin. Z yığını oluşturmak için yaklaşık beş mikrometre arayla kesit aralıkları kullanın. Hem kan damarlarını hem de tümör ksenogreftini görmek için iki kanallı görüntüleme kullanın.
Görüntü tümör ksenogreft ve bir larva için kan damarları, ve görüntülenecek her larva için bu adımları tekrarlayın. Zebrabalığı ksenogreftine anjiyojenik yanıtın nicel olarak başlaması için, daha önce oluşturulan Z destesi konfokal görüntü dosyalarını 3D görüntü analiz yazılımında yeni bir klasöre aktarın. Tümör ksenogreft hacmini ölçmek için Tümör Hacmi protokolünü oluşturmak için, pencerenin üst menüsündeki Ölçüm sekmesine gidin ve ardından nesneleri bul adlı protokolü, Ölçü yapmak için Nesneleri Bul başlıklı alana sürükleyin protokoller listesinden.
Bu protokolün tümör kanalındaki nesneleri ölçmek üzere ayarlandıktan sonra, Clip To ROI adlı protokolleri sürükleyin ve Bu iki komutun Nesneleri Bul tarafından tanımlanan nesnelere uygulanmasını sağlayarak, Protokoller listesinden Burada Ölçüler Alanı'na Sürükleme Görevleri alanına YG'yi yapın. Bu protokolün ayarlarını ayarlamadan önce, pencerenin sol üst kısmındaki Mode etiketinin üzerindeki açılır menüye gidin ve Genişletilmiş Odak görünümünü seçin. Her kanal başlığının altındaki siyah daireyi tıklatarak en sağdaki bölmedeki tümör olmayan kanalları seçin, böylece sadece tümör kanalı görülebilir.
Sonra ilgi bir bölge çizmek için pencerenin üst kısmında Freehand aracını kullanın, ya da ROI, tüm tümör hacmi etrafında. Resmin altındaki panelde Özet etiketini seçin ve ardından popülasyon ikisini göstermek için Görüntü seçeneğini ayarlayın. Nesneleri Bul görevinde kalibrasyon yapmak için ayarlar penceresini açmak için yıldız işaretine tıklayın.
Yoğunluğu kullanarak eşiği ayarlayın ve arka plan floresandeğil, yalnızca tümör hücreleri seçilene kadar alt eşiği belirleyin. Minimum nesne boyutunu 100 metreküp olarak ayarlayarak, hücre enkazının daha küçük öğelerinin aksine, yalnızca bozulmamış hücrelerin ölçülmesi için minimum nesne boyutunu belirleyin. Üst menüdeki Ölçümler sekmesini tıklatArak ve Protokolü Kaydet'i tıklatarak bu protokolü Tümör Hacmi olarak kaydedin.
Tüm ksenogreftleri ölçmek için aynı ayarları kullanın. Ksenogreftle ilişkili kan damarlarının hacmini ölçmek için, üst menüye giderek ve ölçümler sekmesine tıklayarak ve ardından Protokolü Temizle'yi tıklatarak yeni bir protokol oluşturun. Nesneleri Bul ve RoIs görevleriiçin Klips'i bu protokol için Ölçüm Yapmak Için Görevleri Buraya Sürükley in başlıklı alana sürükleyin.
İlk komutun kan damarı kanalındaki nesneleri ölçmek için ayarlandığından ve aşağıdaki komutun ilk komuttarafından tanımlanan nesnelere uygulanacak şekilde ayarlandığından emin olun. Sonra sadece kan damarları görülebilir, böylece aşırı sağ bölmede olmayan damar kanalları seçin. Daha önce açıklanan Tümör Hacmi protokolüne benzer şekilde Damar Hacmi protokolünün ayarlarını belirleyin ve bu protokolü Damar Hacmi olarak kaydedin.
Protokolü temizleyin ve ksenogreftin etrafına bir yatırım getirisi çizin, tümör dışı otofloresan içermez. Bu YG'nin içindeki tümör kanalındaki nesnelerin hacmini ölçmek için Ölçümler sekmesini tıklatın, Protokolü Geri Yükle komutunu seçin, Tümör Hacmi protokolünü seçin ve Geri Yükle'yi tıklatın. Tümör Hacmi protokolü tarafından yapılan yeni YG'yi kullanarak, Ölçümler sekmesini tıklatın ve Protokolü Geri Yükle komutunu seçin, Damar Hacmi protokolünü seçin ve bu YG'nin içindeki damar kanalındaki nesnelerin toplam hacmini hesaplamak için toplam satırı tıklatın.
Damar hacmini tümör hacmine bölün ve yanıtı 100 ile çarpın ve greft vaskülarizasyonunun yüzde değerini elde edin. İmplantasyon sonrası altı, 24 ve 48 saat tek bir ksenogreft görüntülenmesiyle, farklı zaman noktalarındaki anjiogenik yanıt, implantasyon sonrası 24 ila 48 saat arasında en büyük anjiyojenik yanıt ve 48 saat civarında görülen maksimum greft vaskülarizasyonu ile hesaplanabilir. Döllenme sonrası zebra balığı embriyosuna iki gün içinde yerleştirilen Bir B16-F1 ksenogreftkonfosonucu konfokal zaman atlamalı görüntüleme, ksenogreft yoluyla büyüyen GFP etiketli kan damarlarını gösterir ve memeli tümörlerinde görülen anormal vasküler ağın tipik düzensiz boyut ve morfolojisi damarları ile bir büküm ağı oluşturur.
VEGFR inhibitöründe inkünogretler, DMSO'da inkünogret kontrolüne göre büyük damar redüksiyonu göstermektedir. Kontrol embriyolarında, B16-F1 hücrelerinin implantasyonundan sonra gözlenen tipik anjiyojenik yanıt olan tüm ksenogreft bölgesiboyunca geniş bir vasküler ağ vardı. Kantitatif edildiğinde, anjiyojenik yanıt kontrollere kıyasla VEGFR inhibitörü ile tedavi edilen ksenogreftlerde greft vaskülarizasyonunda belirgin bir azalma gösterir.
Tümör kanalı, otofloresans gösteren yumurta kesesi altına floresan olarak etiketlenmiş B16-F1 hücrelerinin kütlesini gösterir. Bu nedenle, bir Yatırım Getirisi dikkatle ksenogreft etrafında çizilmelidir, sarısı kese herhangi bir otofloresan içermemeye dikkat. Tümör Hacmi protokolü RoI'daki tüm B16-F1 hücrelerini tanımladı, hacimlerini ölçtü ve Yatırım Getirisi'ni hacmine kesti.
Tümör Damar Hacim Protokolü Bu yeni kırpılmış RoI B16-F1 hücrelerinin kütlesi ile ilişkili tüm damarların belirlenmesine izin ve hacimlerini ölçülen. Tümör Hacmi ve Tümör Damar Hacmi protokollerinden alınan değerler greft vaskülarizasyonu ölçüsü vermek için kullanılabilir. Zebra balığının genetik yolla ability ve geçirgenliği tümör anjiyogenezinde yüksek sinyal yollarının araştırılmasına olanak sağlar ve aynı zamanda anti-anjiyojenik bileşikleri tanımlamak için bir tarama platformu olarak da hareket edebilir.
