이 프로토콜은 어떻게 형질 전환 제브라피시 애벌레가 종양 xenograft 혈관화의 생체 내 정량적 분석법을 제공하기 위하여 이용될 수 있는지 설명합니다. 이전 기술에 비해이 기술의 주요 장점은 조사관이 정확하게 xenograft 혈관의 수준에 있는 변경을 양수하는 것을 허용한다는 것입니다. 중요한 단계는 종양 세포가 후속 화상 진찰 및 양 단계가 손상되지 않도록 제브라피시 애벌레에 정확하게 주입되는지 확인하는 것입니다.
형광염으로 B16-F1 세포를 성장하고 라벨을 붙인 후 이식을 위한 배아를 준비하기 시작합니다. 35mm 접시에 E3 용액의 2%메틸셀룰로오스를 접시의 1/4에 채웁니다. 이송 파이펫을 사용하여 이전에 준비된 약 50개의 형질 성 배아를 메틸셀룰로오스에 배치하면서 전송된 E3 용액의 양을 최소화합니다.
마이크로 모세관 파이펫 팁을 사용하여 배아를 정렬하여 모두 머리위로 수직으로 향하고, 꼬리를 아래로, 왼쪽이 위로 있는 배아를 정렬합니다. 이전에 준비된 B16-F1 셀 펠릿에 50%ECM을 추가하여 2대 1 비율로 ECM에 세포의 혼합물을 생성합니다. 파이펫팅과 교반으로 잘 섞은 다음 혼합물을 얼음에 보관합니다.
마이크로 카세필리 파이펫을 사용하여 세포의 3 ~10 마이크로 리터를 차지하십시오. 파이펫 팁을 이전에 준비된 미세 주입 바늘에 조심스럽게 삽입한 다음 B16-F1 매트릭스 혼합물을 바늘 끝으로 배출합니다. 바늘을 바늘 홀더에 넣고 45도 각도로 기울어 접시에 기울입니다.
핀셋을 사용하여 바늘 끝을 부러뜨려 세포를 압박하지 않고 바늘에서 배출 될 수있는 세포를 충분히 크게 만듭니다. 사출 장치에 부착된 가압 공기 실린더를 켜고, 잠시 연속 모드에서 인젝터를 연속 모드로 돌려 1초 이상 바늘끝까지 세포를 밀어넣습니다. 바늘을 배아의 노른자 낭쪽으로 가리키고, 바늘의 끝이 노른자 낭에서 나타났을 때까지 복부 방향으로 노른자 주머니를 통해 밀어 내고 배아의 복부 측에 배아 표피를 밀어 넣고, 단지 후면이 심장으로 밀어 넣습니다.
표피와 노른자 낭 막 사이의 작은 공간을 만들 때까지 바늘 끝을 조심스럽게 약간 밀어 넣습니다. 인젝터를 펄스하여 일부 세포 혼합물을 이 인식 공간으로 배출합니다. 이식되는 이노이식의 크기, 모양 및 위치를 주의 깊게 살펴보고, 그에 따라 바늘의 펄스 수와 위치를 조정하여 올바르게 이식된 이종이이식을 보장한다.
500 내지 800 세포가 각막 공간에 주입될 때까지 펄스를 반복하여 노른자 낭의 바닥을 따라 길의 적어도 절반을 확장하는 눈에 보이는 벌지를 만듭니다. 배아에서 바늘을 제거합니다. 모든 배아를 주입 한 후, 마이크로 카세필리 파이펫 팁을 사용하여 모든 배아를 함께 밀어 서 가능한 한 적은 메틸 셀룰로오스로 피펫 처리 할 수 있습니다.
배아를 PTU와 메틸렌 블루로 E3를 함유한 복구 접시로 옮깁니다. 그런 다음 배아 주위에 E3를 부드럽게 피펫하여 세척한 다음 섭씨 34도에서 배양합니다. 그런 다음 공초점 현미경을 사용하여 마취 된 배아를 이미지화합니다.
종양 세포에 적합한 레이저 채널을 사용하여 이미지화되는 부피를 결정하여 접목의 어느 한쪽 에 적어도 하나 또는 두 개의 광학 섹션을 허용합니다. Z 스택을 만들기 위해 5 마이크로미터 간격을 사용합니다. 2채널 이미징을 사용하여 혈관과 종양 이종이 이식을 모두 이미지화합니다.
종양 이노이식과 혈관을 하나의 애벌레에 대해 이미지화하고 각 유충을 이미지화할 각 단계를 반복합니다. 제브라피시 제노이식에 대한 혈관신생 반응의 양으로 시작하기 위해 이전에 생성된 Z 스택 공초점 이미지 파일을 3D 이미지 분석 소프트웨어의 새 폴더로 옮긴다. 종양 xenograft 볼륨을 측정하기 위한 종양 볼륨 프로토콜을 만들려면 창의 상단 메뉴의 측정 탭으로 이동한 다음 프로토콜 찾기라는 프로토콜을 드래그하여 개체 찾기라는 제목의 공간으로 드래그하여 측정을 수행합니다.
이 프로토콜이 종양 채널의 개체를 측정하도록 설정된지 확인한 후 클립 이라는 프로토콜을 ROI로 드래그하고 프로토콜 목록에서 채우기에서 측정 공간을 만들기 위해 채우기에서 ROI를 만들어 개체 찾기에서 식별한 개체에 이 두 명령이 적용되는지 확인합니다. 이 프로토콜의 설정을 보정하기 전에 창 왼쪽 상단에 있는 모드 레이블 위의 드롭다운 메뉴로 이동하여 확장 포커스 보기를 선택합니다. 각 채널 제목 아래의 검은 원을 클릭하여 맨 오른쪽에 있는 창에 있는 비종양 채널을 선택 해제하여 종양 채널만 볼 수 있도록 합니다.
그런 다음 창 상단의 Freehand 도구를 사용하여 모든 종양 부피 주위에 관심 영역 또는 ROI를 그립니다. 이미지 아래 패널에서 요약 레이블을 선택한 다음 표시 옵션을 설정하여 도면 2를 표시합니다. 개체 찾기 작업에서 보정하려면 별표를 클릭하여 설정 창을 엽니다.
강도를 사용하여 임계값을 조정하고, 배경 형광이 아닌 종양 세포만 선택될 때까지 낮은 임계값을 결정합니다. 최소 오브젝트 크기를 최소 개체 크기를 100입방 마이크로미터로 설정하여 셀 이물질의 작은 항목과 달리 그대로 셀만 측정되도록 결정합니다. 상위 메뉴의 측정 탭을 클릭하고 프로토콜 저장을 클릭하여 이 프로토콜을 종양 볼륨으로 저장합니다.
모든 제노이식을 측정하기 위해 동일한 설정을 사용합니다. xenograft 관련 혈관의 양을 측정하려면 상단 메뉴로 이동한 다음 측정 탭을 클릭한 다음 프로토콜을 지우는 새 프로토콜을 만듭니다. 개체 찾기 및 클립 을 ROI로 드래그하여 이 프로토콜에 대한 측정을 수행하려면 여기에 작업 드래그작업이라는 제목의 공간으로 드래그합니다.
첫 번째 명령이 혈관 채널의 객체를 측정하도록 설정되어 있는지 확인하고 다음 명령이 첫 번째 명령에 의해 식별된 개체에 적용하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 혈관만 볼 수 있도록 극우 창에 있는 비 혈관 채널을 선택 해제합니다. 이전에 설명한 종양 볼륨 프로토콜과 유사한 방식으로 선박 볼륨 프로토콜에 대한 설정을 결정하고 이 프로토콜을 용기 볼륨으로 저장합니다.
프로토콜을 지우고, 어떤 비 종양 자동 형광을 포함하지 않도록주의, xenograft 주위에 ROI를 그립니다. 이 ROI 내부의 종양 채널에서 개체의 부피를 측정하려면 측정 탭을 클릭하고 프로토콜 복원 명령을 선택하고 종양 볼륨 프로토콜을 선택하고 복원을 클릭합니다. 종양 볼륨 프로토콜에 의해 만들어진 새로운 ROI를 사용하여 측정 탭을 클릭하고 복원 프로토콜 명령을 선택하고, 선박 볼륨 프로토콜을 선택하고, 합계 행을 클릭하여 이 ROI 내부의 선박 채널내의 개체의 총 볼륨을 계산합니다.
혈관 부피를 종양 부피로 나누고, 해답을 100으로 곱하여 이식 혈관화의 백분율 값을 얻습니다. 6, 24 및 48 시간 이식 후 개별 이뇨 이식을 이미징함으로써, 다른 시점에서 혈관 신생 반응을 계산할 수 있으며, 이식 후 24~48시간 사이의 가장 큰 혈관 신생 반응과 48시간 경에 볼 수 있는 이식 혈관화의 최대 수준을 확인할 수 있습니다. 2일 간 이식된 B16-F1 이종이이식의 공초점 시간 경과 이미징은 Xenograft를 통해 성장하는 GFP 라벨혈관을 나타내며, 포유류 종양에서 볼 수 있는 비정상적인 혈관 네트워크의 전형적인 불규칙한 크기와 형태학적 혈관을 형성하는 꼬임 네트워크를 형성한다.
VEGFR 억제제에서 배양된 제노이식은 DMSO에서 배양된 대조군 이노이식에 비해 큰 혈관 감소를 보여준다. 대조군 배아에서는 B16-F1 세포의 이식 후 관찰된 전형적인 혈관신생 반응인 전체 제노이식 부위를 가로지르는 광대한 혈관망이 있었다. 정량화되면 혈관신생 반응은 대조군과 비교할 때 VEGFR 억제제-처리된 제노이식에서 이식혈관화의 명확한 감소를 나타낸다.
종양 채널은 자동 형광을 표시하는 노른자 낭 아래에 형광으로 표시된 B16-F1 세포의 질량을 보여줍니다. 따라서, ROI는 노른자 낭에서 자동 형광을 포함하지 않도록주의, xenograft 주위에 신중하게 그려져야한다. 종양 볼륨 프로토콜은 ROI내의 모든 B16-F1 세포를 식별하고, 부피를 측정하고, ROI를 그들의 부피에 클리핑하였다.
이 새로운 잘린 ROI에서 종양 혈관 부피 프로토콜은 B16-F1 세포의 질량과 관련된 모든 혈관의 식별을 허용하고 그들의 부피를 측정하였다. 종양 부피 및 종양 혈관 부피 프로토콜의 값은 접목 혈관화의 척도를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 제브라피시의 유전적 기관성 및 투과성은 종양 혈관 신생에 있는 높은 신호 통로의 조사를 허용하고, 또한 항 혈관신생 화합물을 확인하기 위하여 검열 플랫폼으로 작동할 수 있습니다.
