Ekstra hücresel veziküllerin depolama stabilitesi, prospektif terapötik kullanımları için önemli bir parametredir. Protokolümüz, depolamanın vezikülleri nasıl etkilediğini değerlendirmek için kolayca uygulanabilir bir araç sağlar. Tekniğimizin en büyük avantajı, glukuronidaz'ı eksojen bir belirteç olarak tanıtarak, farklı ana hücrelerden elde edilen hücre dışı veziküllerin depolanabilirlik açısından kolayca karşılaştırılmasıdır.
Asimetrik akış alanı akış fraksiyonu veya AF4, çok hassas bileşikler için boyut dışlama kromatografi saflaştırma hafif bir alternatiftir. Çünkü bileşikler kanalda daha az stresle karşılaşır. Glukuronidaz hassas bir enzim olduğu için, mevcut ların kalitesi kapsamlı planlama ve arınma ve analiz için arka arkaya adımların yürütülmesinden yararlanır.
Bu hücreler için standart koşullara göre ilgi hücre hattı kültürlendikten sonra, serum ücretsiz veya ekstra hücresel vezikül tükenmiş orta ile supernatant değiştirin ve ek bir 24 ila 72 saat için hücre kültürü kuluçka hücreleri iade. Kuluçka sonunda, her şişeden süper natant toplamak ve hücreleri tortu örnekleri santrifüj. Peletrahatsız etmeden hücre klimalı orta dikkatle toplayın.
Ve hücre enkaz ve büyük agregalar kaldırmak için tekrar orta santrifüj. Sonra dikkatle ultracentrifuge tüpler içine supernatants aktarın. Sabit bir açı rotoru kullanıyorsanız, santrifüj sonrası hücre dışı vezikül peletinin alınmasını kolaylaştırmak için tüplerin santrifüjdeki yönünü işaretleyin.
Ultracentrifugation sonunda, dikkatle ekstrasellüler vezikül pelet rahatsız etmeden supernatant atmak için bir serolojik pipet kullanın. 0.2 mikrometre gözenek 200 mikrolitre ilk ultracentrifuge tüp artık supernatant PBS filtrelenmiş. Pelet imal edildikten sonra, tüm ekstrasellüler vezikül peletleri yeniden askıya alınana kadar sonraki peletin yeniden askıya alınması için ortaya çıkan ekstrasellüler vezikül süspansiyonunu bir sonraki tüpe aktarın.
Mililitre başına 1,5 miligramlık son konsantrasyona son resuspended pelet çözeltisine beta glukuronidaz ekleyin. Ve saponin mililitre başına 0.1 miligram lık son konsantrasyona. Daha sonra üç saniye girdap ile iyice karıştırın ve aralıklı hafif flicking ile 10 dakika oda sıcaklığında reaksiyon yerleştirin.
Glukuronidaz kapsüllendikten sonra, tarafsız depolama stabilitesi sonuçları elde etmek için sonraki tüm saflaştırma vezikül değerlendirme adımlarını aynı gün gerçekleştirdiğinden emin olun. Bir boyut dışlama kromatografi sütun pbs en az iki sütun hacimleri saponin kuluçka hemen sonra pelet arındırmak için hazır ile denge. Arındırmak için, kolona 400 mikrolitreye kadar hücre dışı vezikül süspansiyonu ekleyin.
Sonra eluate bir mililitre fraksiyonları toplamak. Hücre dışı veziküllerin kontamine proteinlerden ve serbest glukuronidazlardan ayrılmasını sağlamak için, üreticilerin talimatlarına göre protein konsantrasyonunu bicinchoninic asit tsay ile ölçün. İlgili alet ve vezikül tipi için optimize edilmiş parametreleri kullanarak, hücre dışı vezikül boyutunu ve konsantrasyonunu ölçmek için bir nano parçacık izleme analiz cihazı kullanın.
Glukuronidaz aktivitesini ölçmek için, saflaştırılmış ekstrasellüler 125 mikrolitre taze hazırlanmış floresan di-beta-D-glukuronit 25 mikrolitre ekleyin ve siyah 96-iyi plaka bir kuyu örnek ekleyin. 480 nanometre uyarma ve 516 nanometre emisyon bir plaka okuyucu üzerinde zaman sıfır floresan üretimini ölçün. Buharlaşmayı azaltmak için plakayı şeffaf plastik folyo ile sıkıca kapatın.
Daha sonra 37 santigrat derecede 18 saat boyunca ışıktan korunan plakayı kuluçkaya yatırın. Sadece gösterildiği gibi plaka okuyucu üzerinde 18 saat floresan üretimini ölçün. Ekstrasellüler vezikül liyofilizasyonu için, saflaştırılmış veziküllere trehalose mililitre başına dört miligram ekleyin.
Ve vezikülleri eksi 80 derecede en az bir saat dondurun. Numuneleri lizifleştirmek için, bir lyophilizer'ın raf sıcaklığını 15 dereceye, basıncı 0,180 milibara ayarlayın. Vezikülleri bu koşullar altında 46 saat kurutun.
Ana kurutma adımının sonunda raf sıcaklığını 25 dereceye, basıncı 0035 milibar'a ayarlayın ve numuneleri bu koşullar altında iki saat kurutun. Sonra lyophilized örnekleri dört santigrat derecede saklayın. Depodan sonra numuneleri yeniden sulandırmak için, liyofilizizasyondan önce hücre dışı vezikül süspansiyonunun hacmine eşit bir su hacmi ekleyin.
Depolamadan sonra enzim aktivitesini değerlendirmek için, bir AF4 cihazını mobil faz için yeni hazırlanmış 0,1 mikrometre filtrelenmiş PBS ile yükleyin ve çözücüden gelen parçacık gürültüsünü azaltmak için pompadan sonra pik giriş filtresine 0,1 mikrometre filtre membranı takın. Söküldükten sonra, AF4 için küçük kanalı millEq su ile temizleyin. Moleküler ağırlığı 30 kilodalton kesilmiş yeni bir rejenere selüloz membran hydrate ve parlak tarafı ile perde üstüne membran yerleştirin.
Kanalın üst yarısının altına 350 mikrometrelik geniş bir boşluk yerleştirin ve kanal parçalarını birleştirin. Bir tork tornavida kullanarak, vidaları önce beş Newton metrelik bir torka, sonra da yedi Newton metrelik torka sıkın. Bir crisscross desen blok etrafında vida sıkma.
Kanalları giriş, çıkış ve çapraz akış bağlantı noktasını tutulmaya bağlayın. Sonra membranı dengelemek için en az üç eski örnekten. Dakikada bir mililitreye ayarlanmış dedektör akışı ve odak akışı ve dakikada 0,2 mililitre lik bir enjekte akışı ile bir fraksiyon çalışması programlayın.
Bir dakikalık ön odaklama adımından sonra, sekiz dakika boyunca dakikada iki mililitreden dakikada 0,1 mililitreye çapraz akışı azaltmadan önce, numuneyi odak ve enjekte adımında 10 dakikalık bir süre boyunca enjekte edin. 10 dakika çapraz akış olmadan bir elution adım ile kesirasyon çalıştırmak bitirmek ve elution ve enjeksiyon bir yıkama adım ekleyin, bir elüsiyon ardından. Daha sonra dakikada iki mililitrelik bir başlangıç çapraz akışı ile bir sonraki çalışma için kanal dengeleyin ve UV dedektörü 280 nanometre ayarlayın.
Tüm programlar ayarlandığında, numunenin 300 mikrolitresini enjekte edin ve ASTRA yazılımına UV ve ışık saçılma sinyallerini kaydedin. 12 buçuk dakika sonra, enjeksiyon sonrası 27 dakika kadar bir mililitre fraksiyonları toplamaya başlar. Sonra bir glukuronidase tahlil ve gösterildiği gibi bir nano parçacık izleme analizi gerçekleştirin.
Burada, farklı koşullar altında yedi gün depolandıktan sonra insan vasküler endotel hücrelerinden izole edilen hücre dışı veziküllerin boyutu ve hücre dışı veziküllerin boyutu taze bir örnekle karşılaştırıldığında gösterilmiştir. Veziküller daha sonra AF4 saflaştırmasına tabi tutuldu ve partikül başına glukuronidaz aktivitesi ölçüldü. Hem boyut dışlama kromatografisi hem de AF4 ekstrasellüler vezikülü serbest glukuronidazdan ayırmada başarılıdır.
Parçacıklar ve serbest enzim arasında AF4 için daha yüksek ayrışma derecesi nedeniyle, vezikül içeren fraksiyonların kontaminasyonu daha az olasıdır. Depolama dan sonra AF4 saflaştırma numunelerden serbest enzim kaldırır ve böylece parçacık başına kurtarılan enzim aktivitesi miktarını düşürür. Bu etki en çok dört santigrat derecede depoedildikten sonra belirgindir ve bunun için 2/3 azalma gözlenir.
Bu ek arıtma adımı atlayarak enzim stabilitesi hakkında yanlış varsayıma yol açabilir. İletim elektron mikroskobu, kriyoprotektif olmadan liyofilize edilen hücre dışı veziküller için büyük şekil farklılıkları göstermez. Taramalı elektron mikroskobu görüntülemesi ise eksi 80 derece depolanmış numunelerde bulunmayan liyofilize numunelerde agregaların varlığını ortaya koymaktadır.
Glukuronidaz tsay'dan önce serbest enzimin veziküllerden uzaklaştırılması çok önemlidir. Bu nedenle vezikül arınması için kullanılan tekniğin iyice değerlendirilmesi gerekmektedir. Saflaştırılmış parçacıklar da depolama membran proteinleri veya şekerlerin doğal bileşimi değişti olup olmadığını öğrenmek için yüzey yükü açısından bakılabilir.
Tekniğimiz ile, mevcut aktivite için bilinen belirli belirteçler veya tahliller olmasa bile, hücre dışı vezikül depolama stabilitesi hakkında ilk endikasyon elde etmek mümkündür.
