Yeni edinilmiş direnç mekanizmalarının incelenmesi kansere dirençli ve rezekte edilebilir kanserli hastalarda daha etkili ve güvenli tedavi stratejilerinin geliştirilmesine katkıda bulunacaktır. Ne yazık ki, ilaç direncinin gelişmediği durumlar genellikle rapor edilmemiştir. Bu adım adım doz yükseltme yöntemi edinsel direnç hücreleri elde etmek için en güvenilir teknik olarak kabul edilir.
Uygun afatinib direnci konsantrasyonu belirlemek için, kültür PC-9 hücreleri büyüme orta bir 10 santimetre hücre kültürü tedavi çanak 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit. PC-9 hücrelerini mililitre başına dört kez-10 ila dört hücrede yeniden askıya alın ve hücreleri 96 kuyulu bir mikroplakada 50 mikrolitre hücre süspansiyonu halinde yerleştirin. Hücre kültürü kuluçka bir gecede kuluçka sonra, iyi başına afatinib çözeltisi 50 mikrolitre ile hücreleri tedavi, belirtilen konsantrasyonları altı çoğaltıyor, ve cull kültür kuluçka bir 96 saatlik kuluçka sonra, her kuyuya MTT boya 15 mikrolitre ekleyin.
Hücre kültürü kuluçka dört saat sonra, her kuyu için solubilizasyon / stop çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin ve gece kuvöz için plaka dönmek. Ertesi sabah, bir mikroplaka okuyucu üzerinde 570 nanometre optik yoğunluğunu ölçün. Sürekli afatinib maruziyeti için, p-100 tabaklarda 10 mililitre büyüme ortamı içeren kültür PC-9 hücreleri, hücreler yer yerleşmesi ulaşana kadar.
Subconfluent kültürleri, ilk kültür çanak başına büyüme ortamı nın dokuz mililitrelik üç yeni P-100 yemeğine aktarın ve hücreleri hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Ertesi sabah, üç kültür yemekleri her setine 0.1 nanomolar veya afatinib yarı maksimal inhibitör konsantrasyonunun 1/10 ekleyin. Afatinib ile tedavi edilen hücreler subconfluent hale geldiğinde, iyice kültürleri karıştırmak için bir mililitrelik pipet kullanın ve yeni P-100 yemekleri taze büyüme orta dokuz mililitre her tabak tan hücrelerin bir mililitre aktarın.
Yeni kültürlere afatinib konsantrasyonunun %10 ila %20 daha yüksek konsantrasyonlarını ekleyin, kültürler10 ila 12 aylık bir süre içinde yer birleştiğinde her seferinde afatinib konsantrasyonunun adım adım yükseltilmesini artırın. Bir mikromolar bir afatinib konsantrasyonu ulaşıldığında, hücrelerin afatinib direnci gelişmiş olduğunu doğrulamak için gösterildiği gibi MTT tsay gerçekleştirin. Hücre hatları için büyüme eğrisi belirlemek için, kültür ebeveyn PC-9 ve hücre kültürü kuluçka büyüme orta üç afatinib dirençli hücre hatları 24 saat.
Büyüme orta konsantrasyonu mililitre başına beş kez-10-üçüncü hücrelerde her kültürden hücreleri yeniden askıya, ve koltuk 12 100 mikrolitre 96-iyi mikroplaka içinde iyi başına her hücre popülasyonunun 12 100 mikrolitre kopyaları. Daha sonra, gösterildiği gibi sıfır, bir, iki, üç, beş ve yedi kültür günlerinde MTT tahlilgerçekleştirin ve uygun bir istatistiksel analiz yazılım programı kullanarak sonuçları çizin. Epidermal büyüme faktörü reseptörü veya EGFR genomik DNA ekspresyonundaki değişiklikleri ters transkriptaz polimeraz zincir analizi ile tanımlamak için, üreticinin talimatlarına göre bir DNA arıtma kiti kullanarak genomik DNA'yı ilgi hücre kültüründen izole edin.
İzole genomik DNA'nın 25-nanogram-mikrolitre konsantrasyonunu bir spektrofotometre üzerinde ölçün. Daha sonra SYBR yeşil ana karışımı kullanarak 50 nanogram genomik DNA'yı yükseltin ve sonuçları floresan bazlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu algılama sistemi kullanarak analiz edin. EGFR genomik DNA ekspresyonundaki değişiklikleri sıralama ile tanımlamak için, EGFR eksonları 19-21 eksperleri için spesifik astarlar kullanarak genomik DNA'yı güçlendirin.
Daha sonra üreticinin talimatlarına göre bir PCR arıtma kiti kullanarak güçlendirilmiş PCR ürünleri arındırın ve amplicons sıralayın. Batı blot analizi ile epidermal büyüme faktörü reseptör protein ekspresyonundaki değişiklikleri belirlemek için, hücreleri 24 saat boyunca afatinib ile tedavi edin. 24 saat sonra, hücre kültürlerini her kültür başına beş mililitre buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.
Lyse radyoimmünoprektasyon tsay tampon hücreleri, ile takviye 1%proteaz inhibitörü kokteyl ve fosfataz inhibitörleri kokteyl iki ve üç için 30 dakika dört derece santigrat. Kuluçka sonunda, santrifüj ile lysates toplamak. Lysate örneklerinin protein konsantrasyonu belirlemek için bicinchoninic asit analizini kullanın.
Protein örneklerini 4-X numune tamponunda mikrolitre konsantrasyonları başına 0,5 veya bir mikrograma ayarlayın ve numuneleri 5 dakika boyunca 96 derecede kaynatın. Örneklerin batı leke analizi için, etanol temizlenmiş cam plakalar ve spacers monte, ve uygun deneysel takviyeleri ile% 8 poliakrilamid jel ile kalıp yükleyin. Jel polimerize iken, uygun bir kalıp istifleme jel çözeltisi ekleyin, tarak eklemek ve istifleme jel oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika polimerize sağlar.
Her iki jel de polimerize olduğunda, elektroforez cihazına yerleştirin ve tankı çalışan tamponla doldurun. Sonra her bir protein numunesi bir 20-30 mikrolitre hacmi her kuyuya yük ve 180 volt jel çalıştırın. Yaklaşık 60 dakika sonra elektroforez durdurun, boya ön jel dışarı akar kez, ve tris-tamponlu tuzlu ile jel yıkayın, Tween ile takviye, bir ila iki dakika.
Proteinleri 300 miliamperlik sabit bir akımda bir ve 1/2 saat yarı kuru lekeler le poliviniliden florür membranına aktarın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca tris-tamponlu salin artı Ara çözeltisi ile seyreltilmiş%5 yağsız kuru süt ile membranı bloke edin. Daha sonra, membranı bir gecede dört santigrat derecede uygun antikorlarla incen.
Ertesi sabah, membranı oda sıcaklığında bire bir ve 1/2 saat boyunca uygun ikincil antikora maruz bırakmadan önce yıkama başına üç adet 10 dakikalık taze tris-tamponlu tuzlu luk yıkayarak yıkayın. Daha sonra membranı yıkama başına taze tris-tamponlu tuzlu ile beş kez yıkayın ve filmleri kullanarak sinyal görselleştirmesi için geliştirilmiş kemilüminesans çözümüne membranı maruz bırakın. Burada, afatinib artan konsantrasyonlarına yanıt olarak ebeveyn PC-9 hücrelerinin hücre çoğalmasında gözlenen azalma gösterilmiştir, PC-9 hücreleri afatinib maruzkalma duyarlı olduğunu doğrulayan.
Ancak, üç afatinib dirençli hücre hatları hiçbiri afatinib maruziyeti altında hücre çoğalması bir bastırma göstermektedir. Afatinib dirençli hücre hatları ebeveyn PC-9 hücrelerine göre önemli ölçüde yavaş büyüme eğrileri sergiler. Afatinib dirençli hücreler, ebeveyn PC-9 hücrelerine göre EGFR genomik DNA ve EGFR protein ekspresyonunun önemli ölçüde daha yüksek düzeylerini ifade eder.
EGFR dizilimi, PC-9 hücrelerinin EGFR ekson 19'da 15 baz çifti silme, ekson 20'de yabani tip EGFR olduğunu göstermektedir. Afatinib dirençli bir ve iki hücre hattı hücreleri, ancak, yabani tip EGFR ekson bir amplifikasyon sergilemek 19. Afatinib dirençli hücre hattı üç hücre PC-9 hücrelerinde olduğu gibi EGFR ekson 19 aynı 15 baz çifti deletiyonları içerir, ancak T790M bir nokta mutasyonu EGFR ekson 20 gözlenir.
Inhibitör konsantrasyonu IC-50 değerine yakın olduğunda hücre büyümesi oldukça yavaş olabilir. Hücre yavaş yavaş çoğalmaya devam edeceği için kültürü tartışmayın. Bu stratejiler, kanser hastalarının edinilmiş direnç mekanizmalarını değerlendirmek ve güvenli ve etkili tedavi stratejileri geliştirmek için klinik olarak ilgili direnç geliştirdikleri koşulları taklit etmek için geliştirilmiştir.
